王琬凝，董 震,2,3，王志林，陳啟偉，吳錦燕，尚佑軍，劉永生*，蘭 喜*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.甘肅省定西市安定區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅 定西 743000)

鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)是革蘭陰性細(xì)菌，屬于沙門菌 B 群，能廣泛引起人和多種動物的胃腸炎和敗血癥，現(xiàn)在常被用作研究傷寒癥的疾病模型[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌已經(jīng)進(jìn)化出多種蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，利用不同的機(jī)制有效地將效應(yīng)因子運(yùn)輸?shù)桨獠l(fā)揮重要作用，到目前為止，已經(jīng)在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)有 9 種分泌系統(tǒng)[4]。其中 Ⅵ 型分泌系統(tǒng)(the type Ⅵ secretion system,T6SS) 最初在霍亂弧菌中被發(fā)現(xiàn)并廣泛存在于革蘭陰性菌中[5-6]。T6SS 能將效應(yīng)因子由細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜并且直接刺入宿主細(xì)胞內(nèi)[7]。在結(jié)構(gòu)上 T6SS 類似于噬菌體尾鞘結(jié)構(gòu)，呈針筒狀[8]。rhs基因所表達(dá)的 RHS 蛋白為 T6SS 的效應(yīng)因子，能通過 T6SS 輸出到外界和宿主細(xì)胞[9]。目前在鼠傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)了2個rhs基因，分別為rhs1 和rhs2，不同的是rhs1 內(nèi)部可分為 3 段，為 N 端、核心區(qū)(core)和C 端，rhs2 沒有 N 端，只有核心區(qū)和 C 端，因此，rhs1 和rhs2 一共有 5 個內(nèi)部元件。各元件之間的分割標(biāo)志是核心區(qū)兩邊的高保守區(qū)域，rhs2 只有核心區(qū)下游和C端之間的高保守序列[10]。在達(dá)卡氣單胞菌中，序列“PVSMVTGEELL”位于 N 端之后且作為rhs核心的起點(diǎn)，而“TPDPxxLAGGxNxYxYxPNPTGWVDPLGL”為核心區(qū)和 C 端之間的高保守序列[11]。本研究所使用的菌株為 CVCC541，以菌株鼠傷寒沙門菌 14028s 的序列作為參考(CP001363.1)通過在 NCBI 上對高保守序列進(jìn)行 BLAST 比對，在rhs1 (STM14_0340)和rhs2 (STM14_0342)中找到了與之對應(yīng)的序列?！癙VDVTTGQKIL”作為位于 N 端之后的rhs核心的起點(diǎn)；“ SQDPIGLRGGLNLYQYAPNPLKYIDPLGL ”在C 端之前作為rhs核心的終點(diǎn)，這一段在rhs1 和rhs2 中都存在。

本研究通過對 Red 同源重組系統(tǒng)各個步驟的條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，敲除了rhs1 基因中 N 端、核心區(qū)(core)、C 端以及rhs2 基因的核心區(qū)和 C 端，成功構(gòu)建了缺失株Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core、Δrhs-2C以及回補(bǔ)株CΔrhs-1N、CΔrhs-1core、CΔrhs-1C、CΔrhs-2core和 CΔrhs-2C，并對缺失株、回補(bǔ)株和親本株進(jìn)行了對HeLa 細(xì)胞的黏附侵襲能力、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 RAW264.7 吞噬后存活能力和對小鼠毒力的探究。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株 CVCC541、試驗(yàn)所需質(zhì)粒 pKD46、pKD4、pCP20、pSTV28 均為實(shí)驗(yàn)室保存。本研究構(gòu)建的缺失株為 Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C，回補(bǔ)株為CΔrhs-1N、CΔrhs-1core、CΔrhs-1C、CΔrhs-2core和 CΔrhs-2C。

1.2 主要儀器和試劑膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、高保真酶、PCR 酶、DL5000 Marker 購自大連 TaKaRa 公司；Fetal bovine serum (FBS)、0.25% Trypsin-EDTA(胰酶)、青鏈霉素(雙抗)、RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素購自北京索萊寶公司；L-(+)阿拉伯糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司；小型離心機(jī)、24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國 Thermo 公司；臺式高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)購自美國 Beckman 公司、PCR 儀、凝膠電泳儀、凝膠成像儀、電擊儀、0.1 mm 電擊杯、購自美國 Bio-Rad 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)以 NCBI 上公布的鼠傷寒沙門菌 14028s 的全基因組序列(CP001363.1)為參考序列，設(shè)計(jì)了目的基因打靶片段引物、缺失鑒定引物和回補(bǔ)擴(kuò)增引物，目的基因打靶片段引物分別選取待敲除的元件序列前后 56 bp 作為同源打靶片段，并分別在其 3′端加上了從 pKD4 質(zhì)粒上能擴(kuò)增卡那霉素抗性基因的上下游引物作為打靶片段引物，引物序列如表1所示(j 為鑒定引物，h 為回補(bǔ)擴(kuò)增引物，下劃線為同源臂)，由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.4 鼠傷寒沙門菌rhs基因相關(guān)元件缺失株構(gòu)建

1.4.1線性打靶片段的構(gòu)建 將 pKD4 質(zhì)粒稀釋10倍作為擴(kuò)增模板，使用相應(yīng)的目的基因敲除引物和高保真酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：96℃ 5 min；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 20s，32 個循環(huán)；72℃ 5 min。將獲取的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增以消除 pKD4 質(zhì)粒的影響，將 5～6 個凝膠孔中的產(chǎn)物收集起來進(jìn)行膠回收，測定濃度后作為線性打靶片段于-20℃保存待用。

1.4.2CVCC541 感受態(tài)的制備及 pKD46 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 將 CVCC541菌液37℃，200 r/min 搖至D600≈0.8，在冰中放置30 min后分裝至 50 mL 離心管，4℃、5 500 r/min 離心 5 min，棄掉上清后加入 20 mL 預(yù)冷的10%甘油，重懸后4℃、5 500 r/min 離心 5 min，重復(fù) 3 次后用 800 μL LB 重懸并分裝至預(yù)冷的 1.5 mL EP 管中，每支 100 μL。將 5 μL pKD46 加入感受態(tài)中輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至冷凍的電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)條件為 200 Ω，25 μF，電壓 2.3 kV，時間 2.5 ms，加入 1 mL LB 吹打后全部吸入至新的 1.5 mL EP 管中，28℃，200 r/min 復(fù)蘇 2～3 h，取 100 μL 涂于含有 50 mg/L 氨芐青霉素抗性的 LB 平板上，28℃倒置培養(yǎng) 1～2 d。將長出的菌落挑單克隆，28℃ 搖至渾濁后通過 PCR 鑒定 pKD46，陽性的即為 CVCC541/pKD46。

1.4.3CVCC541/pKD46 感受態(tài)的制備及線性打靶片段的電轉(zhuǎn)化 CVCC541/pKD46感受態(tài)制備過程見1.4.2。將 5 μL 線性打靶片段加入感受態(tài)中輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至冷凍的電轉(zhuǎn)杯中，使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，條件為 200 Ω，25 μF，電壓為 2.3 kV，電擊時間為 2.5 ms，加入1 mL LB 吹打后全部吸入至新的 1.5 mL EP 管中，28℃、200 r/min 復(fù)蘇 2～3 h，取 100 μL 涂于含有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 平板上，28℃ 倒置培養(yǎng) 2～3 d。挑單克隆菌落，28℃ 搖至渾濁后使用鑒定引物和 2 對交叉鑒定引物通過 PCR 鑒定待敲除片段是否被卡那霉素抗性片段替代，從而篩選出陽性重組子。

1.4.4pKD46 質(zhì)粒的消除 將鑒定為陽性重組子的菌液在含有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 平板上劃線，挑取單克隆至含有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 中，42℃，200 r/min 過夜搖振，第2天將渾濁的菌液分別在含有卡那霉素和氨芐青霉素的 LB 平板上劃線，37℃ 倒置培養(yǎng)，挑選只在卡那霉素抗性的平板生長但不在氨芐青霉素抗性的平板上生長的單克隆，從而獲得不含 pKD46 質(zhì)粒且具有卡那霉素抗性的基因缺失菌株。

1.4.5卡那霉素抗性基因及質(zhì)粒 PCP20 的消除 將不含 pKD46 質(zhì)粒的且具有卡那抗性的基因缺失菌株按1.4.2制成感受態(tài)并加入 5 μL pCP20質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，涂布于含有 50 mg/L 氨芐青霉素的 LB 平板上，28℃ 倒置培養(yǎng)并使用鑒定引物通過 PCR 鑒定，將鑒定為已成功缺失的菌液在無抗性的 LB 平板上劃線，挑單克隆在無抗性的 LB 中 42℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)，將菌液分別在無抗性、含 50 mg/L 氨芐青霉素、含 50 mg/L 的 LB 平板上劃線，挑選只能在無抗性平板上生長且在卡那霉素平板和氨芐青霉素平板上均不能生長的菌株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將 PCR 產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。

1.5 回補(bǔ)株的構(gòu)建

1.5.1回補(bǔ)片段及質(zhì)粒的構(gòu)建 以 CVCC541 為模板，分別用相應(yīng)的引物將需要回補(bǔ)的片段擴(kuò)增出來并進(jìn)行膠回收。使用限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ對擴(kuò)增片段和質(zhì)粒 pSTV28 于 37℃ 雙酶切 5 min 后再次膠回收。使用 T4 連接酶16℃ 過夜連接回補(bǔ)片段和pSTV28質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到 trans-T1 感受態(tài)中，通過含有 50 mg/L 氯霉素的LB平板篩選并通過 PCR 鑒定陽性克隆。將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液通過質(zhì)粒提取試劑盒提出質(zhì)粒并使用pSTV28質(zhì)粒通用引物鑒定。

1.5.2制備缺失株的感受態(tài)及含回補(bǔ)片段質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 缺失株感受態(tài)制備過程見1.4.2。將 5 μL 含回補(bǔ)片段的質(zhì)粒加入感受態(tài)中輕輕吹打混勻，電轉(zhuǎn)條件見1.4.3。37℃，200 r/min 復(fù)蘇 2～3 h，取 100 μL 涂于含有 50 mg/L 氯霉素的 LB 平板上，37℃ 倒置培養(yǎng)過夜。將長出的菌落挑單克隆，37℃ 搖至渾濁后使用pSTV28質(zhì)粒通用引物PCR鑒定，并將 PCR 產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。

1.6 CVCC541 親本株與缺失株的生物學(xué)功能檢測

1.6.1生長曲線測定 分別挑單菌落到 10 mL LB 中，37℃、200 r/min 培養(yǎng)到D600≈0.8 時，按 1∶100 轉(zhuǎn)接到含 100 mL LB 培養(yǎng)基的錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔 1 h 測量D600的值，并使用 GraphPrism 軟件繪制生長曲線圖。取每個菌株D600≈0.7 時的菌液稀釋涂板計(jì)數(shù)。做 3 個平行試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.6.5小鼠致病力試驗(yàn) 將新鮮菌液培養(yǎng)至D600≈0.8，離心后用 PBS 重懸調(diào)整D600=1.0，將菌液稀釋到 10-6,10-7梯度并涂板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)菌數(shù)為 2×109CFU/mL，實(shí)際計(jì)數(shù)以涂板菌落數(shù)為準(zhǔn)。使用 20 g 的雌性昆明鼠，6 只為 1 組，每株菌 5 個梯度，分別為 2×109,2×108,2×107,2×106和2×105CFU/mL，每只小鼠注射 0.2 mL 菌液，陰性對照組每只注射 0.2 mL PBS。觀察 7 d后記錄死亡個數(shù)，并使用改良寇氏法計(jì)算 LD50。

2 結(jié)果

2.1 帶同源臂的卡那抗性片段的擴(kuò)增分別用目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C的敲除引物擴(kuò)增出目的條帶為 1 628 bp 的帶同源臂的卡那抗性片段，為二次擴(kuò)增做準(zhǔn)備(圖1)。

M. DL5000 DNA Marker；1～10.擴(kuò)增含 rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C 同源臂的卡那霉素抗性片段

2.2 缺失株的構(gòu)建分別用目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C兩側(cè)的鑒定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增 CVCC541 菌液，大小分別是 900，3 335，541，697和596 bp。用目的基因兩側(cè)的鑒定引物和 2 對交叉鑒定引物(目的基因鑒定引物-F/Kan-R、Kan-F/目的基因鑒定引物-R)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增由卡那霉素抗性片段替代目的基因的菌株，鑒定引物擴(kuò)增大小分別為1 744，1 770，1 715，1 706和1 785 bp；交叉鑒定引物(目的基因鑒定引物-F/Kan-R，下文以Target gene-F/Kan-R表示；Kan-F/目的基因鑒定引物-R，下文以Kan-F/Target gene-R表示)擴(kuò)增大小分別為1 047，1 007，1 184，1 189和1 210 bp；交叉鑒定引物(Kan-F/目的基因鑒定引物-R)擴(kuò)增大小分別為1 186，1 252，1 020，1 006和1 064 bp；用目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2CPCR 擴(kuò)增各自基因缺失株Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C菌液，大小分別為116，142，87，786和157 bp(圖2)。測序結(jié)果顯示，目的基因已被成功敲除，并且上下同源臂之間都?xì)埩袅?23 bp的疤痕序列。

M.DL5000 DNA Marker；1,7,13,19,25.以目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core 和 rhs-2C兩側(cè)的鑒定引物分別進(jìn)行菌液 PCR 擴(kuò)增親本株 CVCC541 菌液的結(jié)果；2，8，14，20，26.用兩側(cè)鑒定引物 PCR 擴(kuò)增目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core 和 rhs-2C 被卡那霉素抗性片段替換的結(jié)果；3，9，15，21，27.用交叉鑒定引物(Target gene-F/Kan-R)PCR 擴(kuò)增目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core 和 rhs-2C 被卡那霉素抗性片段替換的結(jié)果；4，10，16，22，28.用交叉鑒定引物(Kan-F/Target gene-R)PCR 擴(kuò)增目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core 和 rhs-2C 被卡那霉素抗性片段替換的結(jié)果；5，11，17，23，29.用目的基因rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core 和 rhs-2C 兩側(cè)的鑒定引物PCR擴(kuò)增缺失株Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core 和 Δrhs-2C的結(jié)果；6,12,18,24,30.陰性對照

2.3 回補(bǔ)株的構(gòu)建分別用回補(bǔ)擴(kuò)增引物擴(kuò)增得到待回補(bǔ)的片段 CΔrhs-1N、CΔrhs-1core、CΔrhs-1C、CΔrhs-2core和 CΔrhs-2C，大小分別是1 363，3 874，1 120，1 058和1 168 bp，將構(gòu)建好的回補(bǔ)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)入用各缺失株制備的感受態(tài)，利用氯霉素抗性和PCR鑒定篩選陽性克隆，引物為pSTV28質(zhì)粒的通用鑒定引物，構(gòu)建好缺失株條帶大小為1 456，3 967，1 213，1 151和1 256 bp(圖3)。

M.DL5000 DNA Marker；1～5.擴(kuò)增含 rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C 的回補(bǔ)片段；6.陰性對照

2.4 生長曲線測定從圖4可以看出 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C的生長速率沒有明顯變化，說明 Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和Δrhs-2C對細(xì)菌生長速率沒有顯著影響?；匮a(bǔ)株與親本株和缺失株均無顯著差異(圖5)。D600≈0.7 時菌液的 CFU 均在 108這個數(shù)量級，沒有顯著差異。

圖4 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core 和 Δrhs-2C 的生長速率

圖5 CVCC541、CΔrhs-1N、CΔrhs-1core、CΔrhs-1C、CΔrhs-2core 和 CΔrhs-2C 的生長速率

2.5 HeLa 細(xì)胞黏附試驗(yàn)CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C黏附率分別為 (10.36±1.32)%，(31.87±5.57)%，(36.55±6.10)%，(30.10±5.50)%，(35.34±7.80)%和(30.44±4.43)%；回補(bǔ)株的黏附率分別為(14.44±0.95)%，(15.29±2.10)%，(14.90±1.25)%，(14.93±2.15)%和(14.17±1.59)%(圖6)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明缺失株 Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C對 HeLa 細(xì)胞的黏附能力均有不同程度的上升，與親本株相比黏附能力變化分別為 3.07(P<0.05)，3.53(P<0.05)，2.91(P<0.05)，3.41(P<0.05)和2.94(P<0.05)。這表明rhs1、rhs2 基因每個元件都對細(xì)菌黏附能力有影響。回補(bǔ)株均與親本株相比黏附能力無顯著差異。

圖6 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core 和 Δrhs-2C對 HeLa 細(xì)胞的黏附率

2.6 HeLa 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C侵襲率分別為 (0.07±0.01)%，(1.89±0.38)%，(1.84±0.46)%，(1.51±0.38)%，(1.32±0.27)%和(1.62±0.4)%；各回補(bǔ)株的侵襲率分別為(0.27±0.09)%，(0.27±0.09)%，(0.29±0.07)%，(0.25±0.08)%和(0.28±0.07)%(圖7)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明缺失株Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core、Δrhs-2C對 HeLa 細(xì)胞的侵襲能力均有不同程度的上升，與親本株相比侵襲能力變化分別為 2.58(P<0.01)，2.51(P<0.05)，2.06(P<0.05)，1.88(P<0.05)和2.21(P<0.05)，表明rhs1、rhs2 基因基因每個元件都對細(xì)菌侵襲能力有影響?；匮a(bǔ)株均與親本株相比侵襲能力無顯著差異。

圖7 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core 和 Δrhs-2C 對 HeLa 細(xì)胞的侵襲率

2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 RAW264.7 吞噬后存活試驗(yàn)CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C吞噬后存活率分別為(0.48±0.07)%，(3.30±0.62)%，(3.03±0.48)%，(3.17±0.56)%，(3.14±0.75)%和(2.69±0.51)%;各回補(bǔ)株的吞噬后存活率分別為(1.47±0.36)%，(1.42±0.32)%，(1.43±0.32)%，(1.45±0.34)%和(1.41±0.31)%(圖8)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明缺失株 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力增強(qiáng)，與親本株相比吞噬后存活能力變化分別為 6.85(P<0.01)，6.30(P<0.01)，6.59(P<0.01)，6.52(P<0.01)和5.57(P<0.01)?；匮a(bǔ)株對RAW264.7細(xì)胞的吞噬后存活能力影響略有上升，且均有顯著差異(P<0.05)。

圖8 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core 和 Δrhs-2C在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 RAW264.7 吞噬后的存活率

2.8 小鼠致病力試驗(yàn)通過菌落計(jì)數(shù)測得CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C注入老鼠腹腔菌量的原始濃度分別為 2.23×109，2.01×109，1.68×109，2.09×109，2.57×109和2.3×109CFU，根據(jù)小鼠死亡數(shù)通過改良寇氏法計(jì)算得出 CVCC541、Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C的 LD50分別為4.46×105，1.47×106，2.77×106，8.51×105，1.68×106和2.11×106CFU。由各菌株的 LD50得知Δrhs-1N、Δrhs-1core、Δrhs-1C、Δrhs-2core和 Δrhs-2C在小鼠體內(nèi)的致病力下降了329%，621%，296%，377%和473% ?；匮a(bǔ)株對小鼠致病力分別下降了223%，426%，191%，354%和127%，但仍然未完全回復(fù)到親本株水平。

3 討論

在構(gòu)建缺失株的過程中，大部分研究者在構(gòu)建線性打靶片段時會使用 Dpn1 酶進(jìn)行酶切，再進(jìn)行膠回收，導(dǎo)致線性打靶片段的濃度很難維持在高水平，經(jīng)過 2 次膠回收后片段質(zhì)量濃度一般為 50～80 mg/L，經(jīng)過摸索，我們對制備線性打靶片段的步驟進(jìn)行了優(yōu)化，改為第1步將鑒定好的 pKD4 質(zhì)粒稀釋10倍后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，再對擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物分別使用相同的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，以消除 pKD4 質(zhì)粒的影響，這樣就能獲得濃度很高(200～350 g/L)的線性打靶片段，且此方法操作簡便，既節(jié)省時間又提高了重組的成功率。線性打靶片段和感受態(tài)最好在制備完成后立即使用。

rhs是一個復(fù)雜的基因，盡管它于 1984 年在大腸桿菌中就被發(fā)現(xiàn)，但對它的功能所知甚少[12]。關(guān)于rhs研究最多的是它與細(xì)菌的種內(nèi)和種間競爭有關(guān)[9,13]。本研究中的rhs1 也被稱為rhsmain，可分為 3 段,分別為富含 GC 堿基的 N 端、核心區(qū)和富含 AT 堿基的 C 端，也叫核心延伸；rhs2 也被稱為rhsorphan，因?yàn)樗鄙?N 端[14-15]。其中 N 端的的功能還不太清楚，可能通過 PAAR 起傳遞作用或者和 C 端一起作為分子伴侶使核心區(qū)更好地發(fā)揮功能；C 端是一個毒素結(jié)構(gòu)域，與毒素的分泌相關(guān)，通過自身、main和orphan之間的 C 端以及與周圍細(xì)菌中的rhsC 端不斷的重組來獲得可變的新的 RHS 毒素，從而達(dá)到抑制祖細(xì)胞的作用，對細(xì)菌的競爭和進(jìn)化有著重要的作用[10-11,16]。PEI等[11]認(rèn)為rhs的N端與核心區(qū)之間、核心區(qū)與 C 端之間可以通過自我切割而裂解，rhs1 的N端和 C 端作為分子伴侶協(xié)助核心區(qū)與 T6SS 的 VgrG 基因相互作用，但是 C 端又需要借助 N 端和核心區(qū)來傳遞所分泌的毒素。

細(xì)菌擁有一些毒素-抗毒素(toxin-antitoxin system,TA)模塊，被稱為TA系統(tǒng)。鼠傷寒沙門菌進(jìn)入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后的復(fù)制由rhs基因發(fā)揮 Ⅱ 型毒素-抗毒素系統(tǒng)的作用，鼠傷寒沙門菌能夠借助自身 TA 系統(tǒng)的毒素來調(diào)節(jié)自身的生化活性，而 TA 系統(tǒng)毒素的活性又受到該系統(tǒng)抗毒素的限制，當(dāng)細(xì)菌響應(yīng)不利環(huán)境條件時，毒素迅速從抗毒素中釋放出來發(fā)揮毒性作用，從而減慢了細(xì)菌的生物學(xué)活性[17]。因此rhs1 和rhs2 無論是單缺失還是雙缺失后，缺失株在巨噬細(xì)胞中的增殖能力都會變強(qiáng)，這可能是因?yàn)槠淙鄙?RHS 毒素后在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長速率提高造成的[10]。在前期研究中，實(shí)驗(yàn)室已有鼠傷寒沙門菌rhs1 基因和rhs2 基因的缺失株，并且發(fā)現(xiàn)無論是將rhs1還是rhs2 進(jìn)行敲除，均會導(dǎo)致相較于親本株，該菌對宿主的黏附侵襲及抗吞噬能力上升及對小鼠毒力下降。為了探究rhs基因內(nèi)部元件對以上生物學(xué)功能的影響，本研究分別敲除了rhs的 N 端、核心區(qū)和 C 端元件后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本株相比缺失株在 LB 培養(yǎng)基中生長速率變化不大，但對 HeLa 細(xì)胞的黏附侵襲率和在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的增殖能力均明顯增強(qiáng)，而對小鼠的致病力均明顯降低，表明rhs基因只要有部分缺失就會顯著影響RHS自身毒性功能和對小鼠致病力的發(fā)揮，rhs基因似乎對黏附侵襲起著負(fù)調(diào)控作用，但卻又在該菌的致病力方面承擔(dān)著重要作用，因此，rhs基因可能起著復(fù)雜的雙向調(diào)控作用，使細(xì)菌在進(jìn)化或者免疫逃避中做出正選擇，它可能在細(xì)菌與環(huán)境的相互作用以及細(xì)菌與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用中具有重要作用[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，缺失rhs的 N 端、核心區(qū)或 C 端的任何一個元件，都會增強(qiáng)該菌的黏附侵襲和抗吞噬能力并且顯著降低該菌對小鼠的致病力。但回補(bǔ)株對小鼠的致病力卻并未完全回復(fù)，可能因?yàn)榛匮a(bǔ)株是由質(zhì)粒攜帶回補(bǔ)片段有關(guān)。因此rhs基因的每個元件都在維持RHS功能的正常發(fā)揮方面起著重要作用，rhs基因的各元件可能通過與彼此的相互作用來維持RHS結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定組裝并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，任何一個元件的缺失都會對其結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)揮造成很大的影響。