朱田田 ，張明惠，王富勝，王圓圓 ，栗孟飛，晉 玲 *

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

3.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗，甘肅 蘭州 730000

4.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 定西 743000

5.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070

當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels.具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸之功效[1]，是甘肅省主產(chǎn)道地藥材之一，具有悠久的人工栽培歷史。目前，甘肅省大面積栽培的當歸品種主要通過系統(tǒng)選育獲得，由于在育種過程中所使用的材料僅集中在少數(shù)優(yōu)良品種（系）上，使得所選育的新品種（系）在外觀形態(tài)上極為相似，僅依靠表型特征研究其遺傳差異準確性較低，因此，利用分子生物學(xué)方法鑒別當歸不同品種（系）間的遺傳關(guān)系十分必要。

對于當歸種內(nèi)不同品種（系）的鑒別，盛麗等[2]采用RAPD分子標記對甘肅省當歸種質(zhì)資源進行研究，張宏意等[3]對當歸種質(zhì)資源遺傳多樣性進行AFLP分析，嚴明春等[4]應(yīng)用ISSR-PCR分析法鑒別當歸不同品種。SSR分子標記因其共顯性，穩(wěn)定性高、特異性強等優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛的被運用于農(nóng)作物的種質(zhì)偽和純度檢測，也有研究者用該方法鑒別當歸與其他物種的親緣關(guān)系[5-6]。劉新星等[7]利用SSR標記鑒定當歸的真實性，結(jié)果顯示當歸與近緣屬種間的遺傳距離最小值明顯大于4個產(chǎn)地的當歸種內(nèi)遺傳距離最大值，因此認為SSR標記可有效地區(qū)分當歸與其它近緣屬藥材，但應(yīng)用SSR分子標記對當歸不同品種（系）的研究未見報道。因此，本研究建立了適用于當歸的SSR-PCR反應(yīng)體系，旨在對不同當歸品種（系）間的遺傳關(guān)系進行研究，構(gòu)建不同當歸品種（系）的分子身份證，為當歸新品種（系）選育提供科學(xué)依據(jù)，也為深入開展當歸種質(zhì)純度鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、優(yōu)良性狀標記等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料收集

2019年7月采集甘肅省定西市渭源縣當歸育苗基地（2322 m；35o5′9.3″N，103o58′32.15″E）所有當歸品種（系）樣本，共有11個品種（系）194份樣本，具體樣本信息見表1。所有樣品經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室晉玲教授鑒定為傘形科當歸屬當歸A.sinensis(Oliv.) Diels的葉片。取樣時挑選健康、無病蟲害的新鮮葉片，每個居群隨機選取3～30個樣本，部分材料因受自然災(zāi)害缺失，故樣本數(shù)量較少。采集后裝入含硅膠的密封袋中快速干燥，根據(jù)品種（系）名稱進行編號，帶回實驗室后存放于陰涼干燥處保存。

表1 當歸樣品信息Table 1 Samples information of A.sinensis

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 利用試劑盒法（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）提取所有當歸樣品總DNA，提取方法參照課題組前期研究中的試驗方法[8]。

1.2.2 PCR擴增 采用的10對SSR引物，引物參照Lu等[9]篩選出的引物序列。為了便于進行標記的檢測，每對引物中的正向引物5’端含有熒光標記FAM（blue）、HEX（green），TAMRA（yellow），ROX（red），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25 μL，10×Taq buffer 2.5 μL，BSA牛血清蛋白0.5 μL，DNA模板2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，Taq DNA酶0.5 μL，ddH2O 16.5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；40 s退火；72 ℃延伸30 s；循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；保存結(jié)束4 ℃。擴增產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，將條帶清晰明亮、無拖尾現(xiàn)象且排列整齊的擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行毛細管電泳檢測和STR分型。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用Popgen version 1.31軟件[10]計算各個當歸品種（系）的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei期望雜合度（Nei）等。采用Structure version 2.3.4軟件[11]進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[參數(shù)設(shè)置：Burnin設(shè)為100000；MCMC重抽樣設(shè)為1 100 000；分組數(shù)（K）設(shè)為2～11，均重復(fù)10次]，利用在線工具Structure Harvester并根據(jù)Evanno等[12]的算法計算ΔK，確定最合適的分組數(shù)，利用CLUMPP Version 1.1.2軟件[13]進行重復(fù)抽樣分析，并運用Distruct 1.1軟件[14]進行結(jié)構(gòu)分析的圖形化顯示。應(yīng)用NTSYS軟件[15]構(gòu)建各品種（系）的Nei’s遺傳距離UPGMA聚類樹狀圖。應(yīng)用GenALEx[16]軟件進行AMOVA（analysis of molecular variance）分析（排列檢驗999次）。

1.2.4 DNA分子身份證的構(gòu)建 采用SSR熒光標記毛細管電泳技術(shù)，獲得194個當歸樣品SSR擴增片段的精確相對分子質(zhì)量，并進行數(shù)字加英文字母編碼。將每對引物擴增所有樣品的不同帶型，按當歸樣品編號順序用數(shù)字1～9依次表示，超出9的用英文字母A～Z依次表示，構(gòu)建字符串形式的DNA分子身份證。去除重復(fù)身份證號后，按品種（系）分類，得到不同品種（系）當歸的分子身份證。將對應(yīng)字符串導(dǎo)入在線條碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/html/BCG code128b.php），生成可供掃描的條形碼DNA分子身份證；將不同品種（系）的育種方式、形態(tài)特征特性、品質(zhì)特性及DNA分子身份證代碼等文本信息輸入在線二維碼生成器（https://cli.im/），生成可掃描的二維碼DNA分子身份證[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

由表2可知，11個品種（系）中，平均Na、Ne、I、Ho、He、Nei最大值分別為3.500 0、2.175 8、0.812 2、0.436 7、0.465 1、0.458 3，最小值分別為1.523 9、0.878 1、0.480 2、0.225 0、0.360 0、0.304 2，平均值為2.738 5、1.864 9、0.653 4、0.341 4、0.407 0、0.385 5。

表2 11個當歸品種 (系) 的遺傳信息參數(shù)Table 2 Genetic information of A.sinensis cultivars (lines)

2.2 親緣關(guān)系分析

基于10對SSR引物數(shù)據(jù)，利用popgene軟件計算出當歸不同品種（系）的Nei’s遺傳距離（表3），其遺傳距離在0.026 2～0.281 7，平均遺傳距離為0.127 5，遺傳距離最遠的是新品系D42017-01（N1）和10G輻照品系（10G），遺傳距離最近的是岷歸2號（M2）和岷歸4號（M4）。

表3 當歸各品種 (系) 間Nei’s遺傳距離Table 3 Nei’s genetic distance in A.sinensis cultivars (lines)

為了進一步分析當歸品種（系）間的親緣關(guān)系，利用NTSYS軟件構(gòu)建11個當歸居群的遺傳距離UPGMA聚類圖（圖1）。由圖1可知，在遺傳距離0.17處，11個當歸品種（系）分為2類，在第1大類中又分為2小類，岷歸1號（M1）、岷歸2號（M2）、岷歸5號（M5）、岷歸4號（M4）和岷歸6號（M6）親緣關(guān)系較近聚為一類，新品系D42017-01（N1）和新品系（半紫半綠莖）（N2）親緣關(guān)系較近聚為一類。

圖1 當歸遺傳距離UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of A.sinensis based on Nei’s genetic distance

2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于10個SSR標記對當歸進行了Structure群體結(jié)構(gòu)分析，當K＝5時，ΔK值最大（圖2），當歸樣本被分為了5個小群（圖3和表4），結(jié)合圖和表可以看出，參試當歸樣本沒有按照居群分類，每份資源都由5種顏色組成，資源的雜合度較高。岷歸1號以綠色為主；岷歸2號以綠色和藍色為主；岷歸3號、10G輻射、20G輻射及30G輻射遺傳結(jié)構(gòu)類似，均以藍色為主；岷歸4號和岷歸5號遺傳結(jié)構(gòu)類似，以綠色和黃色為主，岷歸6號以黃色為主，新品系D42017-01（N1）和新品系（半紫半綠）（N2）遺傳結(jié)構(gòu)類似，以紅色為主。AMOVA分析結(jié)果見表5，居群內(nèi)的變異百分比達到78%，不同品系當歸的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。

表4 基于10個SSR位點的當歸群體結(jié)構(gòu)（K=5）Table 4 Population structure of A.sinensis using STRUCTURE based on 10 SSR locus（K=5）

表5 基于10個SSR位點的當歸群體分子方差分析Table 5 AMOVA analysis of A.sinensis populations based on 10 SSR locus

圖2 不同分組數(shù)的ΔK值Fig.2 ΔK of different clusters

圖3 基于10個SSR位點的當歸群體結(jié)構(gòu)（K=5）Fig.3 Population structure of A.sinensis using STRUCTURE based on 10 SSR locis (K=5)

2.4 分子身份證的構(gòu)建

利用10對引物對194個當歸樣本進行SSR熒光標記毛細管電泳，GeneMapper讀取相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)，表6為各引物序列、5’端標記的熒光基團、退火溫度、擴增得到的多態(tài)性條帶總數(shù)、多態(tài)性片段大小及編碼匯總。利用毛細管電泳多態(tài)性片段及編碼信息構(gòu)建DNA分子身份證。對毛細管電泳結(jié)果按表6進行數(shù)字加英文字母編碼，將C25、C32、C34、C03、C019、C023、C024、C027、C028、P9這10對引物按上述順序?qū)⒃?0對引物對應(yīng)的編碼組合，構(gòu)成應(yīng)用當歸不同品種（系）DNA分子身份證，即字符串DNA分子身份證（表7）。如岷歸1號（M1）的一種DNA分子身份證編碼為1111111111，對照表2，第1個數(shù)字1表示引物C25在岷歸1號某一份樣品中的擴增片段，在其多態(tài)性片段梯度中排第1位，第2個數(shù)字1表示引物C32在該樣品擴增的片段，在其多態(tài)性片段梯度中排第1位，其余代碼依次類推（表7）。圖4為引物C028熒光毛細管電泳檢測到的5種特征帶型，對應(yīng)的片段大小分別為268/268、266/266、268/272、266/268、264/264 bp；圖5為引物P9熒光毛細管電泳檢測到的13種特征帶型，對應(yīng)的片段大小分別為139/139、135/137、137/137、125/125、125/137、135/135、137/139、125/139、125/135、135/139、133/135、127/127、123/135 bp。將DNA分子身份證編碼導(dǎo)入在線條碼生成器，生成條形碼DNA分子身份證。將當歸11個品種（系）的主要描述和DNA分子身份證編碼導(dǎo)入二維碼生成軟件，生成二維碼DNA分子身份證?；谧址?、條形碼、二維碼3種形式，成功構(gòu)建出當歸11個不同品種（系）的DNA分子身份證，圖6為構(gòu)建的部分條形碼DNA分子身份證示例和岷歸1號至6號的二維碼DNA分子身份證示例。

圖4 C028毛細管電泳熒光檢測的特征帶型Fig.4 Characteristic band features of the primer of C028 detected by capillary electrophoresis

圖5 P9毛細管電泳熒光檢測的特征帶型Fig.5 Characteristic band features of primer of P9 detected by capillary electrophoresis

圖6 當歸條形碼DNA分子身份證和岷歸1～6號二維碼DNA分子身份證示例Fig.6 Examples of Danggui barcode DNA molecular ID card and mingui No.1—6 QR code DNA molecular ID card

表6 10對引物信息、毛細管電泳結(jié)果及帶型編碼Table 6 Information of 10 pairs of SSR primes and amplification results and code of primers detected with capillary electrophoresis

表7 11個當歸品種 (系) 的分子身份證Table 7 Molecular ID codes of 11 A.sinensis cultivars (lines)

3 討論

SSR是存在于真核生物基因組非編碼區(qū)的一段簡單重復(fù)序列，在物種進化過程中呈現(xiàn)較為保守的特性，因此常用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建和物種鑒別。SSR序列也被稱為微衛(wèi)星序列（microsatellites）[18]和短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR），通常由2～6個重復(fù)的核苷酸構(gòu)成[19]。本研究利用10對SSR引物分析了11個當歸品種（系）的遺傳多樣性，I和Nei的平均值分別為0.653 4和0.385 5。這說明當歸在物種水平上遺傳多樣性較高，與課題組前期用ISSR分子標記得到的結(jié)果一致[20]。與同樣栽培歷史悠久的人參、地黃及同屬的藥用植物杭白芷相比，當歸具有更高的遺傳多樣性[21-23]。當歸11個品種（系）Ho低于He，說明存在自交現(xiàn)象[24]，符合人們從已有的當歸植物中選育當歸新品（系）種的事實。

FIS為種群內(nèi)近交系數(shù)，表示亞群中個體間由于非隨機交配而導(dǎo)致的亞群內(nèi)雜合度的缺失狀況，總近交系數(shù)FIT則反映總?cè)后w中雜合度的缺失程度，其值均在?1～1，近交系數(shù)＞0表示雜合子缺失，近交系數(shù)＜0表示雜合子過剩[25]。FST表示種群間的分化程度，Wright[26]認為FST≤0.05時，種群間分化很小或幾乎無分化；FST在0.05～0.15間時，中等程度分化，在0.15～0.25明顯分化，當FST＞0.25時，種群間極度分化。F檢驗表明，當歸群體的FIS、FIT均為正值（FIS＝0.136，F(xiàn)IT＝0.218），說明當歸的各個品種（系）間存在近交現(xiàn)象，各品種（系）以純合子為主。FST為0.086，說明當歸品種（系）中存在中等程度分化?；蛄鱊m是影響種群分化的一個重要因素，當Nm＜1時，說明各種群間的基因交流水平低，種群可能由于遺傳漂變產(chǎn)生了分化[25]。當歸不同品種（系）間的基因流Nm為2.667，說明當歸品種（系）間存在著較為頻繁的

基因交流。當歸品種初始選育就是對人工栽培種選擇提純復(fù)壯的過程[27]，對不同品種（系）當歸進行了Structure群體結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)Evanno等[12]的算法計算ΔK，確定最合適的分組數(shù)為5，并沒有按品種（系）劃分，且各個品種（系）都由5種顏色組成，資源的雜合度較高，與較低的遺傳分化系數(shù)和較高的基因流均說明，目前當歸選育工作還需要對現(xiàn)有的品種（系）繼續(xù)進行純化。

DNA分子身份證是證實和區(qū)分不同材料的有效證明，具有唯一性、可鑒別性等特點，如今二維碼技術(shù)的運用有效地容納了數(shù)字、文字、字母、圖片等信息，且能夠迅速被電腦、手機等電子設(shè)備全方位識別，大大增加了其使用范圍[17]。分子身份證已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和果蔬的種質(zhì)研究中，而在中藥材領(lǐng)域還處于剛剛起步的階段[27]，一個重要的原因是農(nóng)作物和果蔬往往有幾十到幾百種的種質(zhì)資源[28-29]，且不同種質(zhì)資源選育時間較長，純度較高，品種間差異較大。而中藥材如當歸，雖然有1700多年的人工栽培種植歷史，但其新品種選育工作始于20世紀90年代，隨著當歸3年栽培模式下早期抽薹問題以及隨著當歸種植年限延長，連作障礙凸顯、病蟲害逐年加重，已成為限制當歸產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。當歸不同品種（系）間遺傳分化程度較低，基因交流頻繁，植物鑒別中常用的ITS2條形碼對不同產(chǎn)地（不同來源）的當歸的不能進行有效區(qū)分[30]。本研究采用SSR熒光標記毛細管電泳技術(shù)，獲得194個當歸樣品SSR擴增片段的精確分子量，通過構(gòu)建不同品種（系）當歸的分子身份證，同時又生成條形碼和二維碼2種分子身份證形式，有效區(qū)分了11個當歸品種（系），為當歸新品種選育工作提供科學(xué)依據(jù)，具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突