劉亞鴿，戴 璇，劉田園，王 釤，張悅怡，盧美希，陳貝貝，朱如愿，王麗麗，張東偉

北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 糖尿病研究中心，北京 100029

肥胖是指人體內(nèi)脂肪的過(guò)量累積，與其他組織失去正常比例的一種狀態(tài)，表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞增多和（或）細(xì)胞體積增大。肥胖的發(fā)生與遺傳、生活習(xí)慣及內(nèi)分泌激素失調(diào)等多種因素密切相關(guān)。長(zhǎng)期的肥胖會(huì)誘發(fā)糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)病及心腦血管病等一系列疾病[1]。流行病學(xué)研究顯示，肥胖的發(fā)病率逐年增高，已經(jīng)給個(gè)人和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，并逐漸成為世界上主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2]。近年來(lái)，絕經(jīng)后女性因體內(nèi)雌激素水平下降誘發(fā)骨代謝、肥胖等多種代謝綜合征逐漸引起研究者的興趣[3]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性常伴有體脂分布的改變，主要表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪的積累增多[4]。雖然脂肪組織在生物體內(nèi)能量代謝方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]，但是與肥胖相關(guān)的內(nèi)臟脂肪的過(guò)度積累會(huì)進(jìn)一步增加患代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此，探索內(nèi)臟脂肪組織的代謝及發(fā)展新的治療方案對(duì)于防治絕經(jīng)后肥胖有著重要的意義。

體內(nèi)脂肪的生成主要受過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和 CCAAT/增強(qiáng)劑結(jié)合蛋白 α（CCAAT/enhancer binding proteins α，C/EBPα）等多種成脂轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[7]。研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPα和PPARγ能夠相互調(diào)節(jié)，激活下游靶基因如脂肪細(xì)胞脂結(jié)合蛋白2、脂蛋白脂肪酶和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterolregulatoryelement-bindingprotein-1c，SREBP-1c）等，從而調(diào)控脂肪細(xì)胞的生成[8]。研究也發(fā)現(xiàn)，無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族（wingless type MMTV integration site family，Wnt）信號(hào)是脂肪組織發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，與人類肥胖、體脂分布和代謝功能障礙有關(guān)[9]。Wnt信號(hào)可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞雙向分化的能力，當(dāng)Wnt信號(hào)被阻斷時(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞主要向脂肪細(xì)胞分化[10]。研究表明，Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/βcatenin）通路可以負(fù)調(diào)控成脂轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ[11]，抑制脂肪生成[12]。

女貞子是一種藥食同用的中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“補(bǔ)中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病，久服，肥健輕身不老?！毖芯勘砻鳎懽泳哂锌构琴|(zhì)疏松[13-14]和抗肥胖[15]等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，女貞子可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)骨代謝從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[16]。然而，女貞子能否通過(guò)調(diào)控該信號(hào)通路抑制脂肪生成，進(jìn)而改善絕經(jīng)后肥胖小鼠的脂代謝，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以去卵巢誘發(fā)的肥胖小鼠為模型，探討女貞子對(duì)去卵巢小鼠脂肪生成的影響及其作用機(jī)制，為防治絕經(jīng)后肥胖等代謝性疾病提供新的策略。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠24只，7周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2020-0004。動(dòng)物于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)[合格證號(hào)SCXK（京）2020-0002]，12 h/12 h光暗周期，相對(duì)濕度（55±1）%，室溫（22±1）℃，以正常飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水?dāng)z食，籠具、墊料、飲用水等定期更換清潔。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2020091413-3066）。

1.2 藥材

女貞子購(gòu)自北京同仁堂藥店總店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥博物館馬澤新教授鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。

1.3 藥品與試劑

戊酸雌二醇（批號(hào)J20130009）購(gòu)自德國(guó)拜耳公式；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211028）、三酰甘油（triglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211028）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211027）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211027）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ECL超敏發(fā)光液（批號(hào)20210916）購(gòu)自新賽美生物科技有限公司；Wnt 10b抗體（批號(hào)10011210）、PPARγ抗體（批號(hào)00091738）、C/EBPα抗體（批號(hào)00045016）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)10015666）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)20000311）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)20000261）購(gòu)自 Proteintech公司；β-catenin抗體（批號(hào)L02120962）、p-β-catenin抗體（批號(hào)l10233554）購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.4 儀器

EchoMRI-100H型身體成分分析儀（美國(guó)EchoMRI公司）；FLUO star Omega多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG Labtech公司）；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）；Azure c500型凝膠成像儀（美國(guó)Azure Biosystems公司）；EG1150H型包埋機(jī)、EG1150C型冰凍機(jī)、RM2255型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BX53型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 女貞子水提液的制備

按照郭魚波等[17]的方法制備女貞子水提液：將原生藥材女貞子打成粗粉后，準(zhǔn)確稱取100 g，加入1 L蒸餾水，置于磁力攪拌器上低溫?cái)嚢?8 h后，低溫4000 r/min離心20 min后取上清，然后將上清于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中低溫旋蒸，濃縮至含生藥0.35 g/mL的女貞子水提液，經(jīng)HPLC-DAD-ESI-MS分析，女貞子水提液中主要含有紅景天苷、女貞苷、麥角甾苷、特女貞苷和橄欖苦苷酸等成分[18]。

2.2 去卵巢小鼠模型建立、分組、給藥及樣品處理

按照郭魚波等[17]的方法進(jìn)行造模：將麻醉后的小鼠，切除雙側(cè)卵巢，其中對(duì)照組小鼠在卵巢附近切除同樣大小的脂肪組織。將造模成功的小鼠，隨機(jī)分為模型組、戊酸雌二醇（0.1 mg/kg）組和女貞子（3.5 g/kg，此給藥劑量在本課題組前期研究中已被證明對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥有效[16,18-19]）組，每組6只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)期間，每周稱定各組小鼠的體質(zhì)量。給藥結(jié)束后，各組小鼠ip 1%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，4 ℃、3500 r/min離心10 min后，血清分裝于?80 ℃冰箱保存待用。同時(shí)取各組小鼠的皮下脂肪組織、內(nèi)臟脂肪組織和肩胛處的棕色脂肪組織，其中一部分固定于4%多聚甲醛溶液中用于病理檢測(cè)，其余于?80 ℃冰箱中保存進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 體脂成分測(cè)定

給藥結(jié)束后，采用身體成分分析儀測(cè)定并記錄各組小鼠體內(nèi)脂肪含量，并計(jì)算各組小鼠脂肪與體質(zhì)量的相對(duì)比率。

2.4 內(nèi)臟脂肪組織的蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色

將固定在4%多聚甲醛溶液中的內(nèi)臟脂肪組織按照常規(guī)HE染色法進(jìn)行脫水包埋切片染色，中性樹(shù)膠封片后置于倒置顯微鏡下觀察脂肪組織病理變化并拍照。根據(jù)Shen等[20]的方法計(jì)算脂肪細(xì)胞大小，平均脂肪細(xì)胞大小表示為組織樣本中每個(gè)細(xì)胞的平均橫截面積（μm2/細(xì)胞）。

2.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

2.6 Western blotting檢測(cè)內(nèi)臟脂肪組織蛋白表達(dá)

將內(nèi)臟脂肪組織用RIPA裂解液裂解，采用低溫機(jī)械勻漿的方法提取組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將變性蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入Wnt 10b抗體（1∶6000）、β-catenin抗體（1∶1000）、p-β-catenin抗體（1∶1000）、PPARγ抗體（1∶1000）、C/EBPα抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶20 000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)二抗（1∶4000），室溫孵育1 h，用ECL超敏發(fā)光液顯色，Azure凝膠成像儀拍照。以相應(yīng)的GAPDH作為內(nèi)參，利用Image J圖像分析軟件對(duì)各目標(biāo)條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示。滿足正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)使用近似F檢驗(yàn)。不滿足正態(tài)分布時(shí)，則使用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠體質(zhì)量和體脂分布的影響

如圖1-A～C所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的體質(zhì)量和體脂相對(duì)比率顯著增加（P＜0.05），瘦體質(zhì)量相對(duì)比率顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，各給藥組小鼠的體質(zhì)量和體脂相對(duì)比率顯著下降（P＜0.05），瘦體質(zhì)量相對(duì)比率顯著升高（P＜0.05）。

在體脂分布（圖1-D～F）方面，模型組小鼠內(nèi)臟脂肪組織和皮下脂肪組織相對(duì)比率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而戊酸雌二醇和女貞子水提液能夠顯著降低內(nèi)臟脂肪組織和皮下脂肪組織相對(duì)比率（P＜0.05），棕色脂肪組織相對(duì)比率在各組間無(wú)顯著性變化。上述結(jié)果提示，女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠體質(zhì)量和體脂相對(duì)比率的增加，改善脂肪分布。

圖1 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠體質(zhì)量 (A)、體脂相對(duì)比率 (B)、瘦體質(zhì)量相對(duì)比率 (C)、內(nèi)臟脂肪相對(duì)比率 (D)、皮下脂肪相對(duì)比率 (E) 和棕色脂肪相對(duì)比率 (F) 的影響 ( , n = 6)Fig.1 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on body weight (A), body fat relative ratio (B), lean relative ratio (C),visceral adipose tissue relative ratio (D), subcutaneous adipose tissue relative ratio (E) and brown adipose tissue relative ratio(F) in ovariectomized mice ( , n = 6)

3.2 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪細(xì)胞大小的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪細(xì)胞的大小顯著增加（P＜0.05）。而雌二醇和女貞子水提液干預(yù)后，小鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪細(xì)胞的大小顯著降低（P＜0.05）。說(shuō)明女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪細(xì)胞肥大。

圖2 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪細(xì)胞大小的影響 ( , n = 6)Fig.2 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on adipocyte size of visceral adipose tissue in ovariectomized mice( , n = 6)

3.3 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影響

如圖3所示，模型組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平較對(duì)照組分別升高了52.5%、54.0%和70.9%（P＜0.05），雌二醇和女貞子水提液干預(yù)能顯著降低去卵巢小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平（P＜0.05），但女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠血清中HDL-C水平無(wú)顯著性影響。以上結(jié)果表明，女貞子水提液能夠調(diào)節(jié)去卵巢小鼠的TC和TG代謝，從而改善機(jī)體的脂質(zhì)代謝。

圖3 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響 ( , n = 6)Fig.3 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on TC, TG, LDL-C and HDL-C levels in serum of ovariectomized mice(, n = 6)

3.4 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中成脂轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

本研究主要探究女貞子對(duì)去卵巢小鼠脂代謝的影響。此外，已有研究表明雌二醇能夠通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制成骨細(xì)胞向成脂細(xì)胞的分化[21]，因此，以下機(jī)制研究部分將重點(diǎn)探索女貞子對(duì)脂肪代謝相關(guān)因子的作用。C/EBPα和PPARγ是脂肪生成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[22]。采用Western blotting法檢測(cè)各組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ的蛋白表達(dá)水平，如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，女貞子組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。表明女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ的表達(dá)，從而抑制脂肪過(guò)度生成。

圖4 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中成脂轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα (A) 和PPARγ (B) 蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 6)Fig.4 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on protein expressions of adipogenic transcription factors C/EBPα (A)and PPARγ (B) in visceral adipose tissue of ovariectomized mice ( , n = 6)

3.5 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠內(nèi)臟脂肪組織Wnt 10b蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，女貞子組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中Wnt 10b蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），p-β-catenin/β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，女貞子水提液能夠激活去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

圖5 女貞子水提液對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 6)Fig.5 Effect of Ligustri Lucidi Fructus aqueous extract on related proteins expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway in visceral adipose tissue of ovariectomized mice ( , n = 6)

4 討論

本研究采用經(jīng)典的雙側(cè)去卵巢方法建立絕經(jīng)后肥胖小鼠模型，發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠體質(zhì)量和體脂相對(duì)比率顯著增加，血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高，內(nèi)臟脂肪組織出現(xiàn)脂肪細(xì)胞肥大病變，內(nèi)臟脂肪組織中成脂轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著升高，Wnt 10b蛋白表達(dá)水平顯著降低，p-β-catenin/β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高。而女貞子水提液能夠抑制去卵巢小鼠體質(zhì)量和體脂相對(duì)比率的增加，調(diào)節(jié)血脂水平，降低內(nèi)臟脂肪組織中脂肪生成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，從而改善去卵巢小鼠的脂代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠體質(zhì)量、體脂相對(duì)比率以及血清中TC、TG和LDL-C水平較假手術(shù)組顯著升高。而女貞子水提液干預(yù)后能明顯抑制去卵巢小鼠體質(zhì)量和體脂相對(duì)比率的增長(zhǎng)，降低血清中TC、TG和LDL-C水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。研究表明，脂肪細(xì)胞肥大導(dǎo)致的白色脂肪組織過(guò)度擴(kuò)張是導(dǎo)致肥胖的重要原因[23]。本研究通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪細(xì)胞較假手術(shù)組肥大，而女貞子水提液能夠抑制小去卵巢小鼠的脂肪細(xì)胞肥大。研究也發(fā)現(xiàn)，女貞子水提液的主要成分之一紅景天苷能夠下調(diào)高脂誘導(dǎo)的肥胖大鼠附睪脂肪組織中PPARγ和C/EBPαmRNA表達(dá)，從而改善脂代謝紊亂[24]。紅景天苷也能夠抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化和脂肪的生成，其與抑制PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和adiponectin等脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，女貞子水提液能夠明顯降低去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中C/EBPα和PPARγ的蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明女貞子水提液具有改善去卵巢小鼠脂肪代謝的作用，而紅景天苷可能是其物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

研究發(fā)現(xiàn)，女貞子水提液主要成分之一紅景天苷能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的定向分化[26]。此外，Li等[27]發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)女貞子能夠通過(guò)激活去卵巢大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路，改善骨質(zhì)量[19]。本研究結(jié)果顯示，女貞子水提液能逆轉(zhuǎn)去卵巢小鼠內(nèi)臟脂肪組織中Wnt 10b和p-β-catenin/β-catenin的變化。以上結(jié)果說(shuō)明，女貞子水提液可能通過(guò)調(diào)控Wnt/βcatenin信號(hào)通路來(lái)抑制去卵巢小鼠脂肪細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而發(fā)揮抗肥胖作用。本課題組也發(fā)現(xiàn)女貞子水提液中主要含有紅景天苷、女貞苷、麥角甾苷、特女貞苷和橄欖苦苷酸等主要成分[18]，但是這些成分是否具有抗去卵巢小鼠肥胖的作用尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，女貞子水提液能夠改善去卵巢誘發(fā)的肥胖小鼠的血脂代謝，抑制白色脂肪過(guò)度生成，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究為女貞子的抗肥胖臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)其他抗肥胖藥物的機(jī)制研究提供了策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突