王延濤，孔令梅, ，程 杰，張 淹, ，王春艷，王中超, ，張 燕, ，馬立平, ，齊曉丹*，劉 艷

1.東阿阿膠股份有限公司 國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城 252200

2.山東省膠類中藥技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 聊城 252200

3.山東省膠類中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 聊城 252200

4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700

豬苓湯出自東漢張仲景所著《傷寒論》，是國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄》的第9方[1]，由豬苓、茯苓、澤瀉、滑石、阿膠5味中藥組成，以利水為主，兼以養(yǎng)陰清熱，主治水熱互結(jié)而兼陰虛之證[2]。方中以豬苓為君藥，取其歸腎、膀胱經(jīng)，專以淡滲利水；臣藥澤瀉、茯苓性味甘淡，益豬苓利水滲濕之力，澤瀉性寒兼可泄熱，茯苓尚可健脾以助運(yùn)濕；佐入滑石之甘寒，利水、清熱兩彰其功；阿膠滋陰潤(rùn)燥，既益已傷之陰，又防諸藥滲利重傷陰血。五藥合方，利水滲濕為主，清熱養(yǎng)陰為輔，體現(xiàn)了利水而不傷陰、滋陰而不礙濕的配伍特點(diǎn)。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究及臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)豬苓湯主要應(yīng)用于改善腎功能、抗炎、利尿等[3-7]。除傳統(tǒng)的功能主治外，豬苓湯還可以加減其他藥味或方劑治療腎炎、紅斑狼瘡性腎炎、心律失常、肝硬化等多種疾病[8-16]?？梢?jiàn)該方應(yīng)用價(jià)值廣泛，具有重要開(kāi)發(fā)意義。

對(duì)于經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)目前國(guó)家是推廣和鼓勵(lì)的，近年逐漸發(fā)布了一系列完善詳盡的法規(guī)體系[17-19]?！敖?jīng)典名方基準(zhǔn)樣品”是經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵一環(huán)，是經(jīng)典名方復(fù)方制劑生產(chǎn)的化學(xué)基準(zhǔn)和生物效應(yīng)基準(zhǔn)[20]，是衡量制劑與中醫(yī)臨床所使用的藥用物質(zhì)是否一致的標(biāo)準(zhǔn)，因此，基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。但是目前關(guān)于豬苓湯的報(bào)道主要集中于臨床用藥研究及藥理研究方面，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)報(bào)道較少。為了在經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)中有力支撐豬苓湯的工藝確定和標(biāo)準(zhǔn)制定，本研究特開(kāi)展豬苓湯基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量研究，為其復(fù)方制劑及其他經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

島津LC-20A型高效液相色譜儀，LC-20AT串聯(lián)雙柱塞泵，DGU-20A在線脫氣系統(tǒng)，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BGZ-70鼓風(fēng)式干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XP105型十萬(wàn)分之一電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；ZF-1型三用紫外分析儀，驥輝分析儀器（北京）有限公司；DK-98-11A恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；硅膠G薄層板，青島海洋化工廠分廠，批號(hào)20171029。

對(duì)照品L-羥脯氨酸（批號(hào)111578-201602）、甘氨酸（批號(hào)140689-201605）、丙氨酸（批號(hào)140680-201604）、脯氨酸（批號(hào)140677-201507）、23-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)111846-201705），質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為99.9%、100%、100%、99.9%、99.7%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品澤瀉醇A（批號(hào)BCY-000924）、澤瀉醇B（批號(hào)BCTG-0915），購(gòu)自江西佰草源生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于95%；茯苓對(duì)照藥材（批號(hào)121117-201509）、澤瀉對(duì)照藥材（批號(hào)121081-201406）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；豬苓（批號(hào)180504004）購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司。異硫氰酸苯酯（PITC）購(gòu)自MACKLN公司；乙腈、磷酸，美國(guó)Fisher Chemical公司，色譜純；水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

本研究中所用飲片經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮研究員鑒定，豬苓為多孔菌科樹(shù)花屬真菌豬苓Polyporus umbellatus(Pers.) Fries的菌核；茯苓為多孔菌科臥孔屬真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核；澤瀉為澤瀉科澤瀉屬植物東方澤瀉Alisma orientale(Sam.) Juzep.的干燥塊莖；阿膠為馬科馬屬動(dòng)物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠；滑石為硅酸鹽類礦物滑石族滑石，主含含水硅酸鎂［Mg3(Si4O10)(OH)2］。

15批次豬苓湯基準(zhǔn)樣品所用飲片批號(hào)及產(chǎn)地信息見(jiàn)表1，所有飲片均有相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)報(bào)告，檢查結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》2020年版要求。

表1 15批豬苓湯飲片信息Table 1 Information of 15 batches of Zhuling Decoction

2 方法與結(jié)果

2.1 豬苓湯煎煮方法及樣品制備

豬苓湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物制備過(guò)程中，采用Excel軟件中的RAND程序，對(duì)每個(gè)藥味的15批飲片進(jìn)行隨機(jī)排列，形成不同批次飲片的組合（S1～S15）。

采用陶瓷煎藥壺加蓋煎煮，武火（功率2200 W）煮沸，文火（功率500 W）保持微沸。取豬苓、茯苓、澤瀉、滑石各13.80 g，置2 L煎藥壺中，加水800 mL，加蓋煮沸（加熱約5 min），保持微沸45 min，濾過(guò)，得濾液；趁熱加入阿膠烊化，得豬苓湯湯劑；60 ℃減壓濃縮30 min，濃縮液冷凍干燥24 h，得豬苓湯基準(zhǔn)樣品。

按照同樣方法制備各單味藥樣品及缺阿膠、澤瀉、茯苓、豬苓的陰性樣品。

2.2 特征圖譜方法建立

2.2.1 供試品溶液的制備 按照“2.1”項(xiàng)下方法制備豬苓湯基準(zhǔn)樣品、單味藥樣品和各陰性樣品。精密稱定各樣品凍干粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加丙酮50 mL，密塞，超聲處理（功率800 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0%乙腈溶解，定容至5 mL，濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B，加乙腈溶解，制成質(zhì)量濃度為澤瀉醇A 40 μg/mL、澤瀉醇B 25 μg/mL、23-乙酰澤瀉醇B 23 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，55%～70%乙腈；15～30 min，70%～85%乙腈；30～35 min，85%～95%乙腈；35～45 min，95%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.4 精密度考察 取同一份豬苓湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液（批號(hào)20181112），按照“2.2.3”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果如表2所示，RSD≤5.0%，表明儀器精密度良好。

表2 特征圖譜方法學(xué)考察 (n = 6)Table 2 Methodological investigation of characteristic atlas(n = 6)

2.2.5 重復(fù)性考察 平行制備6份豬苓湯基準(zhǔn)樣品的供試品溶液（批號(hào)20181112），按照“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果如表2所示，RSD≤5.0%，該方法重復(fù)性合格。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份豬苓湯基準(zhǔn)樣品的供試品溶液（批號(hào)20181112），分別于制備后0、2、4、8、10、15、20、24 h，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果如表2所示，RSD≤5.0%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合要求。

2.2.7 特征圖譜的建立與相似度分析 取15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品的供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄50 min色譜圖。用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)15批基準(zhǔn)樣品進(jìn)行色譜圖疊加得圖1-A，并生成對(duì)照特征圖譜，見(jiàn)圖1-B。將特征圖譜進(jìn)行特征峰歸屬，對(duì)應(yīng)圖譜見(jiàn)圖2、3，全方共確定8個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品、豬苓湯樣品、單味藥樣品、各單味藥陰性樣品相關(guān)圖譜色譜峰比對(duì)，峰1～3號(hào)峰來(lái)自于澤瀉，分別為澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B；4～8號(hào)峰來(lái)自于阿膠，通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)資料對(duì)比，均為阿膠中的脂溶性成分[21]。

圖1 15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品的HPLC指紋圖譜 (A) 和特征圖譜 (B)Fig.1 HPLC fingerprint of 15 batches of material benchmarks of Zhuling Decoction (A) and its characteristic chromatogram (B)

圖2 豬苓湯基準(zhǔn)樣品與單味藥對(duì)照?qǐng)D譜Fig.2 Reference spectrum of substance benchmark of Zhuling Decoction and sing-flavor drugs

圖3 豬苓湯基準(zhǔn)樣品與各單味藥陰性樣品對(duì)照?qǐng)D譜Fig.3 Reference spectrum of substance benchmark of Zhuling Decoction and negative samples of each single-flavor drugs

以2號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積；計(jì)算相似度，計(jì)算參數(shù)：以S1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度0.1，15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物（S1～S15）特征圖譜與其對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.989、0.985、0.985、0.971、0.986、0.970、0.997、0.998、0.968、0.988、0.995、0.990、0.995、0.995、0.990，均大于0.95，表明豬苓湯基準(zhǔn)樣品的制備工藝穩(wěn)定，不同批次間的差異較小。

2.3 基準(zhǔn)樣品含量測(cè)定方法建立

本研究以L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸為指標(biāo)成分，建立了豬苓湯基準(zhǔn)樣品的含量測(cè)定方法。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成質(zhì)量濃度為L(zhǎng)-羥脯氨酸80 μg/mL、甘氨酸160 μg/mL、丙氨酸70 μg/mL、脯氨酸120 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取豬苓湯基準(zhǔn)樣品0.2 g，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）30 min，放冷后加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置5 mL安瓿中，加鹽酸2 mL，150 ℃水解1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 衍生化 分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL，置20 mL具塞試管中，精密加入0.1 mol/L PITC的乙腈溶液0.5 mL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液0.5 mL，搖勻，室溫放置1 h，精密加入50%乙腈3 mL，搖勻。精密加入正已烷3 mL，振搖，靜置10 min，取下層溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉水溶液（用醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5）（7∶93）為流動(dòng)相A，乙腈-水（4∶1）為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～11.0 min，0～7% B；11.0～13.9 min，7%～12%B；13.9～14.0 min，12%～15% B；14.0～29.0 min，15%～34% B；29.0～30.0 min，34%～100% B；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫為43 ℃；理論塔板數(shù)按L-羥脯氨酸峰計(jì)算應(yīng)不低于4000，所得HPLC色譜圖如圖4所示。

圖4 混合對(duì)照品 (A)、豬苓湯樣品 (B) 和缺阿膠陰性樣品(C) 的HPLC圖Fig.4 HPLC of reference substances (A), Zhuling Decoction sample (B) and negative sample without Ejiao (C)

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取L-羥脯氨酸10.52 mg、甘氨酸18.57 mg、丙氨酸13.84 mg、脯氨酸9.14 mg，分別置于10 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，精密量取液L-羥脯氨酸1.6 mL、甘氨酸1.8 mL、丙氨酸1.0 mL、脯氨酸2.6 mL置于同一10 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸質(zhì)量濃度分別為168.32、334.26、138.40、237.64μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

精密吸取混合對(duì)照品溶液，分別稀釋2、4、8、16、32倍，取混合對(duì)照品溶液及稀釋后混合對(duì)照品溶液各1 mL，按“2.3.3”項(xiàng)方法衍生化后按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得峰面積。分別以L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程分別為L(zhǎng)-羥脯氨酸Y＝1 491 243.32X+15 954.32，r＝0.999 9，線性范圍26.30～841.60 ng；甘氨酸Y＝2 287 191.79X-28 656.61，r＝0.999 9，線性范圍52.23～1 671.30 ng；丙氨酸Y＝1 772 915.93X-11 323.89，r＝0.999 9，線性范圍21.62～692.00 ng；脯氨酸Y＝1 669 948.55X+10 809.09，r＝0.999 9，線性范圍37.13～1 188.20 ng。結(jié)果表明，4種氨基酸在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度考察 精密量取“2.3.5”項(xiàng)中未稀釋的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算4種氨基酸峰面積的RSD，結(jié)果L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸峰面積的RSD分別為0.15%、0.12%、0.10%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 精密量取同一豬苓湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液（批號(hào)20181112），分別于制備后0、2、6、10、15、20、24 h按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算供試品溶液中L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的峰面積的RSD，結(jié)果L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸峰面積的RSD分別為0.18%、0.13%、1.03%、0.13%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性考察 精密稱取豬苓湯基準(zhǔn)樣品（批號(hào)20181112），平行制備6份豬苓湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算4種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD，結(jié)果L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.22%、1.06%、0.99%、1.39%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率考察 精密稱取已知L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量的豬苓湯基準(zhǔn)樣品（批號(hào)20181112）0.1 g，共6份，分別置25 mL量瓶中，按照比例加入對(duì)照品溶液（對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度：L-羥脯氨酸2.772 4 mg/mL、甘氨酸4.988 8 mg/mL、丙氨酸1.966 8 mg/mL、脯氨酸2.896 0 mg/mL）各3.0 mL，超聲10 min，放冷，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻。精密量取2 mL，按照“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各氨基酸的回收率。結(jié)果顯示，L-羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸的平均加樣回收率分別為97.7%、97.3%、98.7%、98.0%，RSD分別為2.58%、1.55%、1.42%、1.80%；4種氨基酸加樣回收率均符合95%～102%的要求，該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.10 有效成分轉(zhuǎn)移率 按照公式計(jì)算有效成分轉(zhuǎn)移率，結(jié)果如表3所示，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸平均轉(zhuǎn)移率分別為90.89%、90.25%、90.29%、91.28%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)（均值的70%～130%）。根據(jù)15批基準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果，確定豬苓湯中L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的轉(zhuǎn)移率分別為63.62%～118.20%、63.18%～117.30%、63.20%～117.40%、63.90%～118.70%。

轉(zhuǎn)移率＝wm/WM

w為基準(zhǔn)樣品中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，m為基準(zhǔn)樣品樣品量，W為飲片中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，M為飲片投料量

2.3.11 水分 取15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品的供試品，按照2020年版《中國(guó)藥典》四部，通則0832第二法則測(cè)定水分，結(jié)果如表3所示，15批基準(zhǔn)樣品的水分為2.64%～4.84%。

表3 豬苓湯飲片基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率及干膏率Table 3 Transfer rate and paste rate of benchmark samples of Zhuling Decoction

2.3.12 干膏率 按照公式（2）計(jì)算干膏率，結(jié)果如表3所示，15批基準(zhǔn)樣品平均干膏率為21.53%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)（均值90%～110%）。根據(jù)15批基準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果，確定豬苓湯干膏率為19.37%～23.68%。

干膏率＝m×(1-水分)/M

m為基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量，M為飲片投料量

2.4 薄層色譜法研究

豬苓、茯苓兩藥味因存在共同成分，單獨(dú)鑒別時(shí)各自陰性均有影響，因此采用共同鑒別。澤瀉鑒別結(jié)果顯示陰性無(wú)干擾，故澤瀉單獨(dú)鑒別。分別處理按照“2.1”項(xiàng)下方法制備的豬苓湯基準(zhǔn)樣品及各藥味陰性樣品，進(jìn)行薄層鑒別研究。

2.4.1 豬苓、茯苓鑒別 稱取2.0 g樣品，加乙醚50 mL，超聲處理10 min（功率800 W、頻率40 kHz），濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取茯苓對(duì)照藥材、豬苓對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取對(duì)照藥材溶液5 μL，供試品溶液30 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲酸（8∶1∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，置365 nm下檢視。供試品溶液在與對(duì)照藥材溶液相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)。分別處理豬苓藥材、茯苓對(duì)照藥材、豬苓湯基準(zhǔn)樣品及缺豬苓、茯苓的豬苓湯樣品。結(jié)果顯示，豬苓湯基準(zhǔn)樣品中在與藥材溶液相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)，缺豬苓、茯苓的豬苓湯樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

2.4.2 澤瀉鑒別 稱取2.0 g樣品，加甲醇50 mL，超聲處理30 min（功率800 W、頻率40 kHz），濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取澤瀉對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取對(duì)照藥材溶液2 μL，供試品溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯（1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液在對(duì)照藥材溶液相同位置呈現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)。分別處理澤瀉對(duì)照藥材、豬苓湯基準(zhǔn)樣品及缺澤瀉豬苓湯樣品。結(jié)果顯示，豬苓湯基準(zhǔn)樣品中在與對(duì)照藥材溶液相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)，缺澤瀉豬苓湯樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

2.4.3 薄層色譜測(cè)鑒定結(jié)果 取15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品，按照豬苓茯苓鑒別、澤瀉鑒別方法檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品均可見(jiàn)與對(duì)照藥材一致的斑點(diǎn)且陰性無(wú)干擾。

圖5 15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品的薄層色譜Fig.5 Thin-layer chromatograms of 15 batches of Zhuling Decoction benchmark samples

3 討論

3.1 基準(zhǔn)樣品處方劑量和制法

豬苓湯來(lái)源于漢代張仲景《傷寒論》，原方制法描述為：“豬苓（去皮）、茯苓、澤瀉、阿膠、滑石（碎）各一兩。上五味，以水四升，先煮四味，取二升，去滓，內(nèi)阿膠烊消，溫服七合，日三服”?；鶞?zhǔn)樣品制備方法應(yīng)與傳統(tǒng)的煎煮工藝基本相同[22]，需要將古方中劑量折算成現(xiàn)代劑量以便于經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)研究。對(duì)于經(jīng)典名方中劑量的折算及應(yīng)用，需要參考前人考證的量制，也要關(guān)注中醫(yī)理論指導(dǎo)和臨床實(shí)踐結(jié)果。多名專家學(xué)者曾對(duì)漢代劑量進(jìn)行考證，得出1兩可折算成13.8、15.6、7.0 g等結(jié)果[23-24]?？卵┓萚25]和郝萬(wàn)山[26]通過(guò)測(cè)定出土的漢代衡器大司農(nóng)銅權(quán)得出漢代1兩折合15.6 g左右、1斤為250 g，但這個(gè)研究結(jié)論缺乏更多佐證資料，且大司農(nóng)銅權(quán)的標(biāo)稱值不確定。后經(jīng)大量文獻(xiàn)資料查閱整理，發(fā)現(xiàn)國(guó)家計(jì)量總局主編《中國(guó)古代度量衡圖集》中收載東漢百一十斤權(quán)重23 940 g，折合1斤217.63 g，1兩為13.60 g[27]。邱光明從考古實(shí)物佐證、史料記載等全面、綜合、真實(shí)的考證東漢度量衡史，得出東漢與今天的度量衡單位折算為漢代1斤為220 g，1兩為13.8 g。經(jīng)反復(fù)考證和研究，確定漢代“一兩”折合現(xiàn)代劑量為13.8 g。

為考察“1兩折合15.6 g”實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)在“1兩折合13.8 g”折算標(biāo)準(zhǔn)中的適用性，比較了以15.6 g與13.8 g為折算標(biāo)準(zhǔn)所制備樣品（S15.6、S13.8）的出膏量、干膏率、含量測(cè)定指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表4，以13.8 g和15.6 g折算標(biāo)準(zhǔn)所制得樣品干膏率和含量指標(biāo)無(wú)明顯差異（RSD≤5%）。

表4 劑量對(duì)比研究Table 4 Dose comparison study

經(jīng)搜集兩漢時(shí)的量器實(shí)測(cè)容量折算，以“大司農(nóng)”器的實(shí)測(cè)數(shù)值為依據(jù)，折合每升單位量值在196～204 mL，用算數(shù)平均法求得其單位量值為199.4 mL，扣除因制造不精而產(chǎn)生的示值誤差，每升厘定為200 mL[28]。

綜上，豬苓湯劑量“一兩折合13.8 g”“一升折合200 mL”，本研究確定豬苓湯中各藥材用量為13.8 g，總方69 g，每服23 g。豬苓湯制法為用水800 mL，先加入豬苓、茯苓、澤瀉、滑石4味藥煎煮至400 mL，去掉藥渣，再加入阿膠烊化溶解，每次溫服約140 mL，3次/d。

3.2 含量測(cè)定成分選擇

本實(shí)驗(yàn)研究的豬苓湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物（凍干粉）為經(jīng)考察的傳統(tǒng)煎煮工藝制備而成湯劑經(jīng)濃縮干燥后的實(shí)物[29]，基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選擇參考《中國(guó)藥典》成藥中含量測(cè)定質(zhì)量指標(biāo)的選擇要求，即指標(biāo)成分穩(wěn)定且含量不宜過(guò)低。因此，本實(shí)驗(yàn)以藥味在豬苓湯組方中的君、臣、佐、使地位，首先考察了豬苓中麥角甾醇和澤瀉中的23-乙酰澤瀉醇B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在豬苓湯樣品中未檢測(cè)出麥角甾醇，而23-乙酰澤瀉醇B含量低于萬(wàn)分之一，檢測(cè)誤差大。推測(cè)原因是麥角甾醇和23-乙酰澤瀉醇B極性小，水提效果較差。因此，麥角甾醇、23-乙酰澤瀉醇B均不推薦為定量指標(biāo)的成分。在豬苓湯基準(zhǔn)樣品中未發(fā)現(xiàn)來(lái)自于茯苓的定量成分，最終根據(jù)指標(biāo)的穩(wěn)定性和含量，確定以阿膠中的L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸為指標(biāo)成分，建立豬苓湯基準(zhǔn)樣品的含量測(cè)定方法。鑒于《中國(guó)藥典》2020年版中澤瀉增加了23-乙酰澤瀉醇C、阿膠增加了特征多肽的含量檢測(cè)，后續(xù)本研究會(huì)考慮進(jìn)一步對(duì)豬苓湯中的植物藥成分、特征多肽含量指標(biāo)進(jìn)行深入研究。

3.3 檢測(cè)項(xiàng)目確定

為確保豬苓湯中各藥味都能實(shí)現(xiàn)質(zhì)控，達(dá)到國(guó)家部門(mén)相關(guān)規(guī)定中“經(jīng)典名方應(yīng)加強(qiáng)專屬性鑒別和多成份、整體質(zhì)量控制”的要求[17]，同時(shí)也具備確保質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的簡(jiǎn)單實(shí)用性，本研究將性狀、鑒別、水分檢查、特征圖譜及含量測(cè)定共同作為豬苓湯基準(zhǔn)樣品質(zhì)量屬性的檢測(cè)項(xiàng)目。具體檢測(cè)項(xiàng)目?jī)?nèi)容如表5所示。

表5 豬苓湯基準(zhǔn)樣品檢測(cè)項(xiàng)目Table 5 Test items of benchmark samples of Zhuling Decoction

3.4 檢測(cè)結(jié)果分析

本研究對(duì)豬苓湯基準(zhǔn)樣品建立了薄層鑒別方法、HPLC法特征圖譜和指標(biāo)成分含量測(cè)定方法。建立的薄層色譜方法實(shí)現(xiàn)了豬苓、茯苓和澤瀉等藥味的鑒別；通過(guò)HPLC色譜法建立特征圖譜，確定了8個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中3個(gè)峰，以2號(hào)峰澤瀉醇B為參照峰，15批豬苓湯基準(zhǔn)樣品特征圖譜與對(duì)照特征圖譜的相似度均良好。后續(xù)將探索更加準(zhǔn)確的方法增加各藥味的特征信息；通過(guò)HPLC法建立指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，15批基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分平均轉(zhuǎn)移率均在90%以上。

同時(shí)，對(duì)豬苓湯的干膏率及水分進(jìn)行了考察并確定了范圍。研究結(jié)果表明，含量測(cè)定、干膏率、水分均未現(xiàn)離散數(shù)據(jù)（平均值的70%～130%以外），表明制備的15批次豬苓湯基準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)應(yīng)實(shí)物質(zhì)量基本穩(wěn)定。

4 結(jié)論

豬苓湯用藥精煉，組方嚴(yán)謹(jǐn)，本實(shí)驗(yàn)研究了豬苓湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物的制備工藝，并制定了較科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。建立了簡(jiǎn)便、可行、重復(fù)性良好的特征圖譜，可以較全面反映豬苓湯的特征成分信息。通過(guò)干膏率、指標(biāo)成分含量、轉(zhuǎn)移率等的測(cè)定，對(duì)豬苓湯基準(zhǔn)樣品進(jìn)行了質(zhì)量屬性研究，為豬苓湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)，建立了豬苓、茯苓、澤瀉的薄層色譜鑒別方法，實(shí)現(xiàn)了藥味的鑒別要求。

本研究目前除阿膠外未制定其他藥味含量測(cè)定方法，后面將持續(xù)深入研究其他藥味的含量測(cè)定方法，以期使豬苓湯顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系更加全面；在豬苓湯顆粒的后續(xù)開(kāi)發(fā)過(guò)程中將嘗試采用混批投料的方式，以期減小由于批次間差異所導(dǎo)致的質(zhì)量差異。綜上，本研究對(duì)經(jīng)典名方豬苓湯基準(zhǔn)樣品初步建立了質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，以期為經(jīng)典名方豬苓湯制劑的開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供借鑒。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突