高曉培，陳思遠，閔夢嬌，黃毅哲，張國生，路東亮,?，黃書娟

(1.贛南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西省高等學(xué)校功能材料化學(xué)重點實驗室；2.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

嘧啶酮屬于含氮雜環(huán)化合物，其衍生物有著抗病毒、抗癌(圖1a)、抗炎(圖1b)、抗菌等廣泛的藥理活性和生物活性[1-3]，同時嘧啶酮衍生物也是一種十分重要的藥物中間體.近幾年科學(xué)工作者對其進行了許多的研究，發(fā)現(xiàn)嘧啶酮衍生物更多的生物和藥理作用，某些多官能團的嘧啶酮衍生物還被用作鈣通道阻滯劑、抗高血壓劑、拮抗劑、抗氧化劑、抗腫瘤藥、抗炎和抗結(jié)核等藥物[4].由于嘧啶酮衍生物在各個方面的良好表現(xiàn)，近幾年已經(jīng)成為含氮雜環(huán)化合物的研究熱點.

圖1 具有生物活性的嘧啶酮衍生物

在人體及動物的所有蛋白質(zhì)當(dāng)中，科學(xué)工作者對血清白蛋白的研究最為廣泛和清晰.血清白蛋白占血漿中所有球狀蛋白的60%，在血漿中含量十分豐富，且提供近80%的滲透壓.除此之外，血清白蛋白還可以供給營養(yǎng)、緩沖pH值和運輸載體等[5-6].牛血清白蛋白(BSA)與人血清蛋白(HSA)的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列非常相似，并且BSA更容易獲取，所以通常在與小分子藥物相互作用的研究中，選擇BSA作為模型蛋白.BSA中含有583個氨基酸殘基，而在本實驗中發(fā)揮主要作用的只有兩種色氨酸(Trypt-ophan，Trp)，即Trp-314和Trp-213[7].

本文在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，選擇4種不同取代基的嘧啶酮衍生物，研究其與BSA的相互作用，進一步加深人們對嘧啶酮衍生物在體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)運機制的理解，為開發(fā)嘧啶酮類新藥及研究嘧啶酮藥物對人體的作用提供一定的理論依據(jù).同時，通過本實驗可以探究嘧啶酮骨架的結(jié)構(gòu)改造和性能，并研究其對血清白蛋白的結(jié)構(gòu)功能的影響.

1 實驗部分

1.1 主要儀器

渦旋混勻器(Vortex Mixer v8, 上海凌儀實業(yè)有限公司)；pH計(Sartorius Basic pH Meter PB-10,上海人和科學(xué)儀器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6020，鄭州寶晶科技有限公司)；電子天平(CP114, 常州有限公司)；熒光發(fā)光分光光度儀光譜儀(Perkin Elmer Ls 55).

1.2 主要試劑

主要試劑：實驗室已有的d1、d2、d3、d4四種嘧啶酮衍生物，結(jié)構(gòu)如圖2.

圖2 4種嘧啶酮衍生物結(jié)構(gòu)

其他試劑：二甲亞砜(DMSO)(分析純)；牛血清白蛋白(BSA)(Fraction V)；處理方法為標準方法.

1.3 實驗方法

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物猝滅BSA熒光圖

通過熒光光譜法，得到化合物d1至d4在298 K和308 K下對BSA熒光猝滅效果，分別如圖3、圖4所示(注：圖3和圖4中，BSA的熒光強度隨加入的化合物濃度增大而減小.序號1至11表示化合物濃度與BSA濃度之比為0、1、2、3、4、5、6、7、8、10及不加入BSA溶液時的熒光強度).

圖3 化合物d1至d4在298 K下對BSA熒光猝滅的圖

圖4 化合物d1至d4在308 K下對BSA熒光猝滅的圖

由圖3、圖4可知，在298 K和308 K兩種溫度下，我們發(fā)現(xiàn)BSA的熒光強度與化合物濃度存在關(guān)系，進一步分析發(fā)現(xiàn)：化合物濃度增大時，BSA的熒光強度會有規(guī)律的減弱，說明化合物分子與BSA之間的確存在著相互作用.對比d1-d4在10倍于BSA的濃度下，我們發(fā)現(xiàn)在308 K溫度時對BSA熒光猝滅效果比其在298 K時的效果更好，對比化合物d1-d4發(fā)現(xiàn)，化合物d1對熒光的猝滅效果優(yōu)于其他3個化合物，而化合物d3對熒光的猝滅效果最弱.

2.2 化合物與BSA作用機制的研究

通過stern-volmer方程，可以計算出化合物d1至d4在298 K和308 K下與BSA作用的Ksv(Stern-Volmer猝滅常數(shù))，以化合物濃度Q為橫坐標， F0/F為縱坐標(F和F0分別為有/沒有猝滅劑存在時的熒光強度)，得到的標準曲線圖如下所示(圖5).

圖5 化合物d1-d4在298 K和308 K的stern-volmer方程標準曲線圖

通過stern-volmer方程和Ksv=KQ×τ0公式計算可得到化合物d1至d4猝滅BSA熒光的Ksv值與速率常數(shù)KQ，如表1所示：

表1 化合物d1-d4猝滅BSA熒光的Ksv值和速率常數(shù)KQ

由圖表1得知，化合物d1至d4在298 K及308 K 2種溫度下猝滅BSA熒光的速率常數(shù)KQ在數(shù)值上遠大于2×1010L/mol·s.故化合物d1至d4在兩個溫度下猝滅BSA熒光的猝滅類型是靜態(tài)猝滅，即化合物與BSA間形成了復(fù)合物，從而導(dǎo)致BSA的熒光猝滅[8].針對靜態(tài)猝滅，我們使用方程lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlgQ可以求出d1至d4在298 K和308 K下與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n.通過畫圖，以lgQ為橫坐標，lg(F0-F)/F為縱坐標，得到的標準曲線如圖所示(圖6).

圖6 化合物d1至d4在298 K、308 K下與BSA結(jié)合的方程圖

化合物d1至d4在298 K和308 K與BSA的結(jié)合常數(shù)的對數(shù)lgKa和結(jié)合位點數(shù)n如表2所示.

表2 化合物d1至d4與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

分析表2可知，化合物d1至d4與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka幾乎都大于105，與BSA的結(jié)合位點數(shù)n約為1，由此可知化合物d1至d4均與BSA有著相當(dāng)好的結(jié)合能力[9].

利用van't Hoff公式和熱力學(xué)公式可計算出化合物d1至d4在298 K與308 K下和BSA作用的熱力學(xué)常數(shù)，如表3所示.

表3 化合物d1至d4猝滅BSA的熱力學(xué)常數(shù)

由表3可知，化合物d1至d4與BSA結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)△G<0，故化合物與BSA的結(jié)合過程是自發(fā)進行.表中還顯示部分反應(yīng)的△H>0，部分反應(yīng)△H<0，可知雜合體藥物與BSA作用有些是吸熱反應(yīng)，有些是放熱反應(yīng)，但放熱反應(yīng)和吸熱反應(yīng)與藥物分子的結(jié)構(gòu)間無特殊規(guī)律，其絕對值與分子結(jié)構(gòu)間也無特殊規(guī)律.有部分藥物分子與BSA作用的△S>0，另一部分△S<0，可知熵減反應(yīng)和熵增反應(yīng)與藥物分子的結(jié)構(gòu)和取代基的類型間無特殊規(guī)律，且絕對值大小與分子的結(jié)構(gòu)和取代基的類型間也無特殊關(guān)系.

3 總結(jié)

本文通過熒光光譜法分別對4種嘧啶酮衍生物與BSA的相互作用進行了研究.對熒光光譜圖進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明：實驗研究的4種嘧啶酮衍生物都能使BSA猝滅，猝滅類型為靜態(tài)猝滅，并且嘧啶酮衍生物與BSA都有著很好的結(jié)合能力，結(jié)合位點數(shù)約為 1，△G值小于0，說明化合物與BSA的結(jié)合是自發(fā)的.其中△S和△ H 大于 0,說明化合物 d1,d4與BSA結(jié)合以疏水作用力占主導(dǎo)；△S和△H小于0，說明化合物d2,d3與BSA結(jié)合以氫鍵或范德華作用力占主導(dǎo).