◎ 楊亞超，寧夢(mèng)帆，菅 蓁

（1.煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東 煙臺(tái) 264001；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（葡萄酒學(xué)院），山東 煙臺(tái) 264003）

葡萄酒產(chǎn)品生產(chǎn)中會(huì)產(chǎn)生大量葡萄皮渣，葡萄酒皮渣是葡萄釀酒后的副產(chǎn)物，其中主要包括葡萄皮、葡萄籽和酒泥等[1]。酒渣的葡萄籽中仍保留了一部分生物活性物質(zhì)，如原花青素、白藜蘆醇、酒石酸等。原花青素（Procyanidin，PC）由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成，可以阻止自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的途徑，達(dá)到抗氧化效果，是國(guó)際公認(rèn)的最有效的清除體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑，具有抗衰老、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管和增強(qiáng)免疫等多種作用[2]。葡萄酒釀造產(chǎn)生的大量葡萄皮渣主要用于動(dòng)物飼料，會(huì)造成資源的浪費(fèi)。葡萄皮渣還可用于多酚類(lèi)活性物質(zhì)的提取，但因技術(shù)不成熟、工業(yè)化成本較高而難以實(shí)現(xiàn)。本文以煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)5個(gè)品種的酒渣葡萄籽為研究對(duì)象，測(cè)定其原花青素含量以及抗氧化能力，以此為依據(jù)，針對(duì)不同品種的酒渣采取不同的處理方法，以期提高我國(guó)釀酒葡萄廢棄物的利用率，為葡萄酒加工產(chǎn)業(yè)提供新的增值方向。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

選自煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)的白玉霓酒渣葡萄籽、赤霞珠酒渣葡萄籽、貴人香酒渣葡萄籽、蛇龍珠酒渣葡萄籽和霞多麗酒渣葡萄籽；PC標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）（西安皓源生物技術(shù)有限公司）；甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；石油醚（天津市北辰方正試劑廠）；鹽酸（煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司）；香草醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；醋酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ABTS （上海源葉生物科技有限公司）；過(guò)硫酸鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL 16M離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京市華瑞科學(xué)器材有限公司）；真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FCA502電子天平（濟(jì)南恒則成儀器有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用鄭永麗[3]的方法，向燒杯中加入0.100 0 g的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容。分別量取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL和2.5 mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，放于25 mL容量瓶，用甲醇定容。量取上述5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL置于試管中，向試管中加入5%香草醛溶液3 mL和4%鹽酸1 mL，再取1 mL甲醇溶液加入5%香草醛溶液3 mL和4%鹽酸1 mL作為空白對(duì)照。搖晃均勻后進(jìn)行遮光處理，放入水浴鍋中，30 ℃下反應(yīng)30 min。將上述反應(yīng)完成的溶液，在500 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值，繪制原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 酒渣葡萄籽原花青素的提取及含量測(cè)定

（1）原料預(yù)處理。分別取一定量葡萄籽清洗干凈后烘干，研磨后過(guò)60目篩，葡萄籽粉按照1∶5的比例用石油醚脫脂24 h，干燥后避光保存[3-4]。

（2）酒渣葡萄籽原花青素的提取。稱(chēng)量3 g脫脂葡萄籽粉倒入三角瓶里，以70%的酒精作為提取劑，料液比1∶30，充分混合后，放入超聲波清洗器中。在400 W、30 ℃的條件下提取40 min，將提取液離心 （轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1，離心20 min），取上清液，即得到樣品提取液[5]。

（3）酒渣葡萄籽原花青素的含量測(cè)定。采用香草醛-鹽酸法測(cè)定酒渣葡萄籽原花青素含量[6]。取 0.05 mL樣品提取液，甲醇定容至100 mL，得到稀釋液。在試管中加入稀釋液1 mL、5%香草醛溶液3 mL、4%鹽酸溶液1 mL，遮光條件下在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定稀釋液的吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得到提取液中原花青素的質(zhì)量濃度。

1.3.3 酒渣葡萄籽原花青素ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

ABTS被氧化后會(huì)生成陽(yáng)離子自由基，呈藍(lán)綠色，在抗氧化物存在時(shí)，ABTS自由基的產(chǎn)生會(huì)被抑制而發(fā)生褪色反應(yīng)，所以在734 nm下測(cè)定其吸光度值則可計(jì)算出樣品的總抗氧化能力[5]。用醋酸和醋酸鈉配制pH值為4.5的醋酸鹽緩沖液，再配制 2.45 mmol·L-1過(guò)硫酸鉀溶液以及7 mmol·L-1的ABTS溶液，按照1∶1比例混合，常溫避光靜置12～16 h，得到ABTS自由基陽(yáng)離子基液。使用緩沖液稀釋?zhuān)诓ㄩL(zhǎng)734 nm處測(cè)得吸光度為0.700±0.002，得到ABTS的工作液[5-6]。取該工作液4 mL置于試管中振蕩，同時(shí)緩慢向試管中滴加樣品母液，直至顏色全部褪去，此時(shí)樣品的消耗量為2 mL，即最大添加量為2 mL。依據(jù)最大添加量可設(shè)定6個(gè)不同濃度梯度，取6個(gè)盛有 4 mL ABTS工作液的試管，分別向試管中加入0 mL、 0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL及2.0 mL樣液，不足2 mL的用甲醇補(bǔ)足，搖晃均勻后靜置反應(yīng)20 min， 于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度Ai。以甲醇為空白對(duì)照，代入以下公式獲得還原率，ABTS自由基清除率為：

（1）從問(wèn)卷調(diào)查顯示，學(xué)習(xí)有了更大的自主權(quán)，比以前更有樂(lè)趣。70.3%的學(xué)生認(rèn)為這種方式能提供自主學(xué)習(xí)能力的提高。

式中：A0為空白樣吸光度；Ai為試樣吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒渣葡萄籽原花青素含量的評(píng)價(jià)

2.1.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，在4～20 μg·mL-1，測(cè)得原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.005 6X+0.000 7，R2=0.996 8，結(jié)果表明原花青素質(zhì)量濃度與吸光度呈較好的線性關(guān)系。

2.1.2 原花青素含量測(cè)定結(jié)果

5個(gè)品種酒渣葡萄籽原花青素含量如圖2所示。5種酒渣葡萄籽中原花青素的含量分別為白玉霓 82.7 mg·g-1、赤霞珠77.4 mg·g-1、貴人香114.2 mg·g-1、蛇龍珠188.7 mg·g-1以及霞多麗112.5 mg·g-1。原花青素含量最低的為赤霞珠，其含量為77.4 mg·g-1，蛇龍珠酒渣中原花青素的含量最高，為188.7 mg·g-1。

2.2 ABTS自由基清除力評(píng)價(jià)

不同品種酒渣葡萄籽原花青素的ABTS自由基清除力如圖3所示，隨著加入樣液體積的不斷增加，其對(duì)ABTS自由基的清除率也逐漸增大，蛇龍珠清除自由基能力最強(qiáng)，在加入樣液1.2 mL后其清除率的增長(zhǎng)幅度趨于平緩。在加入相同體積樣液的情況下，樣品對(duì)ABTS自由基清除力大小依次為蛇龍珠＞貴人香＞霞多麗＞白玉霓＞赤霞珠，蛇龍珠、貴人香、霞多麗和白玉霓的最高清除率可達(dá)到100%。

3 結(jié)論與討論

在紅葡萄酒的釀造過(guò)程中葡萄的皮渣得到浸漬，皮渣中的原花青素因?yàn)槠ぴM(jìn)入酒中而損失。但蛇龍珠酒渣葡萄籽中的原花青素含量卻達(dá)到了188.7 mg·g-1， 推測(cè)皮渣中原花青素的含量主要是由釀酒葡萄品種自身來(lái)決定，今后可以對(duì)同一品種采用不同釀造方式的酒渣葡萄籽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索釀造方式對(duì)酒渣葡萄籽原花青素含量的影響[7]。

在物質(zhì)的抗氧化性研究中，通常通過(guò)脂質(zhì)的氧化降解、自由基的清除、螯合金屬離子以及利用物質(zhì)還原能力等機(jī)理進(jìn)行體外研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)酒渣葡萄籽中的原花青素抗氧化性研究?jī)H通過(guò)測(cè)試其ABTS自由基清除能力來(lái)實(shí)現(xiàn)，方法較為單一，后續(xù)可使用FRAP法測(cè)試酒渣葡萄籽對(duì)鐵離子的還原能力，并以此為依據(jù)來(lái)綜合評(píng)定酒渣葡萄籽原花青素的抗氧化能力。