◎ 張 華

（臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000）

本次研究使用VITEK2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP）和實(shí)時熒光PCR（Real-Time PCR）等方法[1]，分別對標(biāo)準(zhǔn)菌株和12株沙門菌野生菌株進(jìn)行測定，對比不同檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，得出效果更好的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究準(zhǔn)備了13株沙門菌，其中1株是鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，均在廣東省食品檢驗所寄存。菌株經(jīng)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）鑒定合格，參照沙門菌屬診斷血清鑒定、分型查找Kauffman-White表，將具體的血清型確定下來，相關(guān)的菌株信息如表1所示。

1.2 試劑與儀器

沙門氏菌免核酸提取核酸檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：KF104，蘇州先達(dá)基因科技有限公司）；VITEK2 COMPACT革蘭氏陰性菌鑒定卡（北京普納德科技有限公司）；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司）；沙門氏菌核酸檢測試劑盒（蘇州先達(dá)基因科技有限公司）和NA平板（上海研生實(shí)業(yè)有限公司）。

QuantStudio 6 Flex實(shí)時熒光定量PCR儀；AC2-4S1生物安全柜；Deaou-308C恒溫擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)；DHP-9052生化培養(yǎng)箱和MALDI-TOF/TOF 4800基質(zhì)輔助激光吸解析電離飛行時間質(zhì)譜儀。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 菌株復(fù)蘇和分純

把瓷珠捕獲的菌株放在5 min的腦心浸出液肉湯內(nèi)培養(yǎng)24 h，期間溫度控制在35～37 ℃。取培養(yǎng)液1環(huán)，接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24 h，期間溫度控制在35～37 ℃，單菌落的純化工序完成。

1.3.2 VITEK2 COMPACT生化鑒定菌株

挑選以上NA平板中的新鮮單菌落，操作時按VITEK2 COMPACT革蘭氏陰性菌鑒定卡的說明書進(jìn)行，用VITEK2 COMPACT來鑒定菌種，再重復(fù)上述流程，鑒定2次即可。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定菌株

挑選以上NA平板中的新鮮單菌落，厚薄均勻地在VITEK MS靶板上進(jìn)行涂抹，為避免空氣中氣凝膠含有的微生物干擾到實(shí)驗結(jié)果，要第一時間將HCCA基質(zhì)液加進(jìn)靶孔，等基質(zhì)晾干，把靶板信息輸?shù)劫|(zhì)譜儀里面，從而鑒定菌株的種屬信息，并重復(fù)上述流程，鑒定2次即可[2]。

1.3.4 LAMP鑒定菌株

（1）DNA模板制備。將BHI菌液當(dāng)作沙門氏菌增菌液，提取時嚴(yán)格按細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒的說明完成。

（2）試劑配制、加樣和檢測。在試劑的配制、加 樣、檢測過程中，要嚴(yán)格按沙門氏菌核酸檢測試劑盒的說明來完成，并重復(fù)上述流程，鑒定2次即可。

1.3.5 Real-time PCR法鑒定菌株

在鑒定上述所備的BHI菌液時，必須嚴(yán)格按沙門氏菌核酸檢測試劑盒的操作說明書進(jìn)行，并重復(fù)以上流程，鑒定2次即可。

1.3.6 對比4種方法的鑒定結(jié)果

通過比較4種方法得出的鑒定數(shù)據(jù)，對比4類實(shí)驗對菌株種屬的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 VITEK2 COMPACT生化鑒定結(jié)果

在生化鑒定實(shí)驗中，被鑒定為沙門氏菌的菌株占比達(dá)到100%，其中達(dá)到種水平的只有1株特殊血清型的菌株。其余只能達(dá)到沙門菌屬的水平，2次測定出來都完全相同[3]，具體如表1所示。

表1 4種鑒定方法結(jié)果對比表

2.2 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

在該項鑒定實(shí)驗中，被鑒定為沙門氏菌的菌株占比達(dá)到100%，且均達(dá)到種的水平，其中有1株是腸沙門菌雙相亞利桑那亞種，腸炎沙門氏菌腸亞種12株，兩次測定結(jié)果一樣。

2.3 LAMP鑒定結(jié)果

在該鑒定實(shí)驗中，沙門陽性菌株13株，LAMP引物只能增加目的基因的數(shù)量，其中有1株野生型沙門氏菌菌株出現(xiàn)假陰性的鑒定結(jié)果，兩次測定出來都完全相同，具體如表1所示。

2.4 Real-time PCR鑒定結(jié)果

在該鑒定實(shí)驗中，菌株以沙門陽性體現(xiàn)的占比達(dá)到100%，其陽性對照的CI值為19.841，剩余菌株的Ct值只有13.183～16.576，兩次測定結(jié)果都完全相同[4]，具體可參照表2所示。

表2 4種方法鑒定沙門氏菌檢測時間和準(zhǔn)確率對比表

2.5 對比4種方法的鑒定結(jié)果

從表2可看出，這4種方法，都可以將沙門氏菌準(zhǔn)確鑒定出來，從沙門氏菌屬的層面分析，準(zhǔn)確率為100%，達(dá)到了極高的檢出率水平，這足以證實(shí)，它們在檢測沙門氏菌中的表現(xiàn)都相當(dāng)出色。在檢測用時方面，排在第一位的是MALDI-TOF MS，除此之外，在檢測期間觀察到LAMP會出現(xiàn)假陰性的情況。結(jié)合表1、表2中的數(shù)據(jù)信息對比可以了解到，不論是MALDI-TOF MS還是VITEK 2 COMPACT，都未能提取出3號、7號的亞利桑那沙門氏菌亞種，在對12號菌株進(jìn)行鑒定的過程中，前者給出的結(jié)果不夠精確，造成2種方法鑒定沙門氏菌種水平上的準(zhǔn)確率直線下滑，前一種只有76%的準(zhǔn)確率，后一種達(dá) 到84%。

2.6 分析4種方法的鑒定結(jié)果

在本次的研究中，熒光定量PCR法運(yùn)用單對通用引物鑒定沙門氏菌具有較高的準(zhǔn)確率和較大的檢測量等特點(diǎn)，同時還可以將食物中含量不高的致病菌識別出來，靈敏性極強(qiáng)，由于是單對通用引物，檢測只能到屬以下，但在實(shí)驗室快速初篩中非常適用。但要鑒定到種，應(yīng)采取多重PCR方法，這種方法雖然比較便捷，準(zhǔn)確度也高，但極易出現(xiàn)交叉污染的問題，易導(dǎo)致最終結(jié)果發(fā)生變化。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法的準(zhǔn)確率極高，方便省時，易判定結(jié)果，但可能會出現(xiàn)假陰性的問題。相對于Real-time PCR來說，二者均處核酸層面，步驟相似，特異性好，但Real-Time PCR對溫度循環(huán)的要求較低，不需要特殊設(shè)備，效率也更高[5]。

MALDI-TOF MS本身具有高特異性、高靈敏度、高通量等一系列優(yōu)點(diǎn)，但在本次的研究中，對于沙門氏菌種層面的準(zhǔn)確度不足，其自身可能會受到多個因素的影響，例如對于基質(zhì)液的選擇、病原微生物的培養(yǎng)、菌株的處理和數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建等方面。雖然目前檢測所需要的費(fèi)用與VITEK2 COMPACT相比有一定的減少，但自身的儀器和設(shè)備較為昂貴，在使用時，對環(huán)境和技術(shù)人員都有很高的要求。因此，該方法可以用于大量食源性病株的初步選擇，但在基層的推廣方面還需要進(jìn)一步的完善和優(yōu)化[6]。

VITEK2 COMPACT生化鑒定系統(tǒng)的準(zhǔn)確率以及實(shí)際的完成率都明顯較高，但部分食源性的疾病監(jiān)測依然處于初期發(fā)展模式，其自身的優(yōu)勢為監(jiān)測費(fèi)用較低，效率更快。

3 結(jié)論

目前沙門氏菌的檢測還是以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)實(shí)驗為主要手段，費(fèi)時費(fèi)力，且流程復(fù)雜。同時受某些生化試劑、血清質(zhì)量不穩(wěn)定、特異性不好等因素的影響，導(dǎo)致鑒定結(jié)果誤差大，不符合快速檢測的標(biāo)準(zhǔn)。因此，傳統(tǒng)模式的沙門氏菌培養(yǎng)和分離檢測方法，會給食品衛(wèi)生檢測實(shí)驗室增加負(fù)擔(dān)，不能滿足國家的實(shí)際需求，而VITEK2 COMPACT的檢測模式和方法，可以提高工作效率，減少污染，提高企業(yè)的競爭力。

綜上所述，從沙門氏菌屬角度來看，4種方法都可以將沙門氏菌短時間內(nèi)檢測出來，其中Real-Time PCR、VITEK 2生化鑒定系統(tǒng)以及MALDI可以在國家食品監(jiān)督抽檢、地方監(jiān)督抽檢中作為輔助檢驗法使用，有助于對LAMP方法進(jìn)行完善。