◎ 張 華

（臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000）

本次研究使用VITEK2 COMPACT全自動微生物分析系統、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）、環(huán)介導等溫擴增法（Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP）和實時熒光PCR（Real-Time PCR）等方法[1]，分別對標準菌株和12株沙門菌野生菌株進行測定，對比不同檢測方法的優(yōu)缺點，得出效果更好的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究準備了13株沙門菌，其中1株是鼠傷寒沙門氏菌標準菌株，均在廣東省食品檢驗所寄存。菌株經《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）鑒定合格，參照沙門菌屬診斷血清鑒定、分型查找Kauffman-White表，將具體的血清型確定下來，相關的菌株信息如表1所示。

1.2 試劑與儀器

沙門氏菌免核酸提取核酸檢測試劑盒（產品編號：KF104，蘇州先達基因科技有限公司）；VITEK2 COMPACT革蘭氏陰性菌鑒定卡（北京普納德科技有限公司）；細菌基因組DNA快速提取試劑盒（南京鐘鼎生物技術有限公司）；沙門氏菌核酸檢測試劑盒（蘇州先達基因科技有限公司）和NA平板（上海研生實業(yè)有限公司）。

QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR儀；AC2-4S1生物安全柜；Deaou-308C恒溫擴增熒光檢測系統；DHP-9052生化培養(yǎng)箱和MALDI-TOF/TOF 4800基質輔助激光吸解析電離飛行時間質譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株復蘇和分純

把瓷珠捕獲的菌株放在5 min的腦心浸出液肉湯內培養(yǎng)24 h，期間溫度控制在35～37 ℃。取培養(yǎng)液1環(huán)，接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24 h，期間溫度控制在35～37 ℃，單菌落的純化工序完成。

1.3.2 VITEK2 COMPACT生化鑒定菌株

挑選以上NA平板中的新鮮單菌落，操作時按VITEK2 COMPACT革蘭氏陰性菌鑒定卡的說明書進行，用VITEK2 COMPACT來鑒定菌種，再重復上述流程，鑒定2次即可。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定菌株

挑選以上NA平板中的新鮮單菌落，厚薄均勻地在VITEK MS靶板上進行涂抹，為避免空氣中氣凝膠含有的微生物干擾到實驗結果，要第一時間將HCCA基質液加進靶孔，等基質晾干，把靶板信息輸到質譜儀里面，從而鑒定菌株的種屬信息，并重復上述流程，鑒定2次即可[2]。

1.3.4 LAMP鑒定菌株

（1）DNA模板制備。將BHI菌液當作沙門氏菌增菌液，提取時嚴格按細菌基因組DNA快速提取試劑盒的說明完成。

（2）試劑配制、加樣和檢測。在試劑的配制、加 樣、檢測過程中，要嚴格按沙門氏菌核酸檢測試劑盒的說明來完成，并重復上述流程，鑒定2次即可。

1.3.5 Real-time PCR法鑒定菌株

在鑒定上述所備的BHI菌液時，必須嚴格按沙門氏菌核酸檢測試劑盒的操作說明書進行，并重復以上流程，鑒定2次即可。

1.3.6 對比4種方法的鑒定結果

通過比較4種方法得出的鑒定數據，對比4類實驗對菌株種屬的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 VITEK2 COMPACT生化鑒定結果

在生化鑒定實驗中，被鑒定為沙門氏菌的菌株占比達到100%，其中達到種水平的只有1株特殊血清型的菌株。其余只能達到沙門菌屬的水平，2次測定出來都完全相同[3]，具體如表1所示。

表1 4種鑒定方法結果對比表

2.2 MALDI-TOF MS鑒定結果

在該項鑒定實驗中，被鑒定為沙門氏菌的菌株占比達到100%，且均達到種的水平，其中有1株是腸沙門菌雙相亞利桑那亞種，腸炎沙門氏菌腸亞種12株，兩次測定結果一樣。

2.3 LAMP鑒定結果

在該鑒定實驗中，沙門陽性菌株13株，LAMP引物只能增加目的基因的數量，其中有1株野生型沙門氏菌菌株出現假陰性的鑒定結果，兩次測定出來都完全相同，具體如表1所示。

2.4 Real-time PCR鑒定結果

在該鑒定實驗中，菌株以沙門陽性體現的占比達到100%，其陽性對照的CI值為19.841，剩余菌株的Ct值只有13.183～16.576，兩次測定結果都完全相同[4]，具體可參照表2所示。

表2 4種方法鑒定沙門氏菌檢測時間和準確率對比表

2.5 對比4種方法的鑒定結果

從表2可看出，這4種方法，都可以將沙門氏菌準確鑒定出來，從沙門氏菌屬的層面分析，準確率為100%，達到了極高的檢出率水平，這足以證實，它們在檢測沙門氏菌中的表現都相當出色。在檢測用時方面，排在第一位的是MALDI-TOF MS，除此之外，在檢測期間觀察到LAMP會出現假陰性的情況。結合表1、表2中的數據信息對比可以了解到，不論是MALDI-TOF MS還是VITEK 2 COMPACT，都未能提取出3號、7號的亞利桑那沙門氏菌亞種，在對12號菌株進行鑒定的過程中，前者給出的結果不夠精確，造成2種方法鑒定沙門氏菌種水平上的準確率直線下滑，前一種只有76%的準確率，后一種達 到84%。

2.6 分析4種方法的鑒定結果

在本次的研究中，熒光定量PCR法運用單對通用引物鑒定沙門氏菌具有較高的準確率和較大的檢測量等特點，同時還可以將食物中含量不高的致病菌識別出來，靈敏性極強，由于是單對通用引物，檢測只能到屬以下，但在實驗室快速初篩中非常適用。但要鑒定到種，應采取多重PCR方法，這種方法雖然比較便捷，準確度也高，但極易出現交叉污染的問題，易導致最終結果發(fā)生變化。

環(huán)介導等溫擴增法的準確率極高，方便省時，易判定結果，但可能會出現假陰性的問題。相對于Real-time PCR來說，二者均處核酸層面，步驟相似，特異性好，但Real-Time PCR對溫度循環(huán)的要求較低，不需要特殊設備，效率也更高[5]。

MALDI-TOF MS本身具有高特異性、高靈敏度、高通量等一系列優(yōu)點，但在本次的研究中，對于沙門氏菌種層面的準確度不足，其自身可能會受到多個因素的影響，例如對于基質液的選擇、病原微生物的培養(yǎng)、菌株的處理和數據庫的構建等方面。雖然目前檢測所需要的費用與VITEK2 COMPACT相比有一定的減少，但自身的儀器和設備較為昂貴，在使用時，對環(huán)境和技術人員都有很高的要求。因此，該方法可以用于大量食源性病株的初步選擇，但在基層的推廣方面還需要進一步的完善和優(yōu)化[6]。

VITEK2 COMPACT生化鑒定系統的準確率以及實際的完成率都明顯較高，但部分食源性的疾病監(jiān)測依然處于初期發(fā)展模式，其自身的優(yōu)勢為監(jiān)測費用較低，效率更快。

3 結論

目前沙門氏菌的檢測還是以傳統的細菌培養(yǎng)、生化反應、血清學實驗為主要手段，費時費力，且流程復雜。同時受某些生化試劑、血清質量不穩(wěn)定、特異性不好等因素的影響，導致鑒定結果誤差大，不符合快速檢測的標準。因此，傳統模式的沙門氏菌培養(yǎng)和分離檢測方法，會給食品衛(wèi)生檢測實驗室增加負擔，不能滿足國家的實際需求，而VITEK2 COMPACT的檢測模式和方法，可以提高工作效率，減少污染，提高企業(yè)的競爭力。

綜上所述，從沙門氏菌屬角度來看，4種方法都可以將沙門氏菌短時間內檢測出來，其中Real-Time PCR、VITEK 2生化鑒定系統以及MALDI可以在國家食品監(jiān)督抽檢、地方監(jiān)督抽檢中作為輔助檢驗法使用，有助于對LAMP方法進行完善。