◎ 韓瑨烜，高 鑫，宋 敏，嚴(yán) 婭

（新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 841100）

氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）是氯霉素類的動(dòng)物專用廣譜抗生素，是畜禽養(yǎng)殖業(yè)常用的一種抗菌效果極好的藥物[1]。氟苯尼考的主要代謝物為氟苯尼考胺（Florfenicol Amine，F(xiàn)FA），因此標(biāo)準(zhǔn)中計(jì)算氟苯尼考?xì)埩袅繒r(shí)通常是計(jì)算以上述兩種物質(zhì)的含量之和。目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)氟苯尼考與氟苯尼考胺殘留量的常見方法，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.5—2021）自2022年 2月1日起開始實(shí)施，實(shí)施后大部分畜禽肉中氟苯尼考的測(cè)定均須按照此標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[2]。

測(cè)量不確定度的評(píng)定可以體現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可靠性，是食品檢測(cè)中質(zhì)量控制的重要內(nèi)容[3-4]。檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則（ISO/IEC17025：2005）要求檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室必須建立并實(shí)施測(cè)量不確定度評(píng)估程序。本文依據(jù)GB 31658.5—2021、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL06：2019）、《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）等標(biāo)準(zhǔn)[5]，對(duì)動(dòng)物性食品中氟苯尼考與氟苯尼考胺殘留量測(cè)定的不確定度進(jìn)行評(píng)定，旨在為采用新標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)時(shí)的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及關(guān)鍵點(diǎn)控制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控樣品。氟苯尼考（99.8%，BePure）；氟苯尼考胺（99.2%，BePure）；氯霉素-D5（100 μg·mL-1，BePure）。

LC-MS 8045超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司）；Hettich 380R型高速冷凍離心機(jī)（德國海蒂詩公司）；YP2002百分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；AUW120d十萬分之一分析天平（日本島津公司）；10～1 000 μL可調(diào)微量移液器（艾本德中國有限公司）；所有玻璃量器均為A級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

按照GB 31658.5—2021中樣品制備方法進(jìn)行。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：C18色譜柱；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：A/B=0.1%甲酸-水/乙腈；流速：0.2 mL·min-1。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI）離子源；正離子（氟苯尼考胺）、負(fù)離子（氟苯尼考、氯霉素-D5）掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；噴霧電壓：3 000 V；去溶劑溫度：500 ℃；氣簾氣壓力： 240 kPa；霧化器壓力：350 kPa。其他參數(shù)詳見表1。

表1 氟苯尼考和氟苯尼考胺主要質(zhì)譜參數(shù)表

2 測(cè)量數(shù)學(xué)模型

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

以配制的工作溶液濃度（μg·L-1）為橫坐標(biāo)，以工作液峰面積與其內(nèi)標(biāo)峰面積之比（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。計(jì)算公式為：

式中：X為試樣中待測(cè)組分的含量，μg·kg-1；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)得試液中待測(cè)組分的質(zhì)量濃度，μg·L-1；m為試樣質(zhì)量，g；V為試樣提取液總體積， mL；f為樣品制備過程中的稀釋倍數(shù)。

2.2 不確定度來源分析

分析測(cè)定過程中不確定度來源，見圖1。

3 分量計(jì)算

3.1 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度ur()

按照樣品處理方法，平行稱取質(zhì)控樣品6份（n=6），根據(jù)公式，計(jì)算出單個(gè)樣品因測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度，結(jié)果見表2。

表2 樣品重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表（n=6）

3.2 樣品溶液制備引入的相對(duì)不確定度

3.2.1 樣品稱量引入的相對(duì)不確定度ur(W樣)

使用精度為0.01 g的天平稱取豬肉樣品，實(shí)際稱量待測(cè)樣品平均質(zhì)量為m=2.01 g，天平校準(zhǔn)證書說明天平最大允許誤差M=±0.05 g，假設(shè)為均勻分布

3.2.2 樣品定容引入的相對(duì)不確定度ur(V樣)

定容溶劑由可調(diào)移液槍吸取500 μL加入，經(jīng)查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）知該移液槍容量允許誤差M=±1.0%，假設(shè)為均勻分布不考慮溫度波動(dòng)引起的溶劑體積變化，則不確定度，相對(duì)不確定度ur(V樣)=

3.2.3 內(nèi)標(biāo)體積引入的相對(duì)不確定度ur(Vis)

內(nèi)標(biāo)由可調(diào)移液槍吸取100 μL加入，經(jīng)查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）知該移液槍容量允許誤差M=±2.0%，假設(shè)為均勻分布不考慮溫度波動(dòng)引起的溶劑體積變化，則不確定度，相對(duì)不確定度

3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的相對(duì)不確定度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)不確定度ur(Cs)

稱取FF標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 08 g和FFA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 0.010 11 g，分別置于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量u(Ws)、10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)）的容量允許差不確定度u(Cs-容-10mL)及實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)不確定度u(Cs-溫-10mL)引入。

經(jīng)查萬分之一天平檢定證書知最大允許誤差M=±0.000 05 g，假設(shè)為均勻分布，則=0.002 84。

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）知10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)）的容量允許差M=±0.020 mL，假設(shè)為均勻分布，則

定容時(shí)實(shí)驗(yàn)室溫度25 ℃，量器校準(zhǔn)時(shí)溫度20 ℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)為0.001 37 ℃-1，假設(shè)為均勻分布，則：

兩項(xiàng)合并得：

因此，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)不確定度ur(Cs-FF)==0.005 00；ur(Cs-FFA)==0.005 00。

3.3.2 內(nèi)標(biāo)工作液配制引入的相對(duì)不確定度ur(Cis)

用移液器量取1.0 mL氯霉素-D5置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度并搖勻，制成濃度分別為 10 μg·mL-1的氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，再用移液槍從儲(chǔ)備液中吸取0.1 mL置于10 mL容量瓶中，制成濃度為0.1 μg·mL-1的氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液。不確定度主要由移液槍的容量允許誤差u(Cis-移)、10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)）的允許差不確定度u(Cis-容)及實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)不確定度u(Cis-溫)引入。

經(jīng)查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）知 1 000 μL移液槍容量允許誤差M=±1.0%，假設(shè)為均勻分布，則不確定度相對(duì)不確定度

已知移液器吸取0.1 mL時(shí)相對(duì)容量允許差的相對(duì)不確定度為0.011 5（3.2.3），10 mL容量瓶定容時(shí)相對(duì)不確定度為0.004 11(3.3.1)，則：

3.3.3 混標(biāo)中間液配制引入的相對(duì)不確定度ur(C混)

使用移液槍分別量取FF、FFA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度并搖勻，制成濃度為1.0 mg·L-1的FF、FFA混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。不確定度主要由移液槍的容量允許誤差u(C混-移)、100 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)）的容量允許差不確定度ur(C混-容-100mL)及實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)不確定度ur(C混-溫-100mL) 引入。

已知移液器吸取0.1 mL時(shí)相對(duì)容量允許差的相對(duì)不確定度為0.011 54（3.2.3）。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）知100 mL單標(biāo)線容量瓶 （A級(jí)）的容量允許差M=±0.10 mL，假設(shè)為均勻分布，則定容時(shí)實(shí)驗(yàn)室溫度25 ℃，量器校準(zhǔn)時(shí)溫度20 ℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)為0.001 37 ℃-1，假設(shè)為均勻分布，則=0.395 mL。

兩項(xiàng)合并得：

因此，混標(biāo)中間液配制引入的相對(duì)不確定度為：

3.3.4 混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的相對(duì)不確定度ur(C工)

用移液槍分別量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20 μL、50 μL定容至100 mL容量瓶中，依次加入氯霉素-D5同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液200 μL，再用移液槍分別量取10 μL、20 μL、50 μL、100 μL至10 mL容量瓶中，依次加入氯霉素-D5同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液20 μL，均由乙腈定容至刻度，配制成FF、FFA濃度依次為2 μg·L-1、5 μg·L-1、 10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1和100 μg·L-1混 合 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中含有氯霉素-D5同位素內(nèi)標(biāo)濃度為20.0 μg·L-1。不確定度主要由移液槍的容量允許誤差u(C工-移)、容量瓶的容量允許差不確定度ur(C工-容)及實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)不確定度ur(C工-溫) 引入。

已知10 mL容量瓶定容時(shí)相對(duì)不確定度ur(C工-10mL) 為0.004 11(3.3.1)，100 mL容量瓶定容時(shí)相對(duì)不確定度ur(C工-100mL)為0.003 99(3.3.3)。經(jīng)查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）知移液槍各吸液量下容量允許差M，假設(shè)為均勻分布，不考慮溫度波動(dòng)引起的溶劑體積變化，各吸液量相對(duì)不確定度的計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 ur(Cis)計(jì)算結(jié)果表

故混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的相對(duì)不確定度為：

3.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度ur(C擬)

FF、FFA標(biāo)準(zhǔn)系列工作液每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定2次，利用工作站繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線信息見表4，計(jì)算結(jié)果見表5。

表4 氟苯尼考、氟苯尼考胺線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)表

根據(jù)公式（2）～（4）計(jì)算得到ur(C擬)，結(jié)果見表5。

表5 ur(C擬)計(jì)算結(jié)果表

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)溶液平均響應(yīng)值差值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；P為樣品平行測(cè)定的次數(shù)，P=6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的總次數(shù)，n=12；為樣品溶液的平均質(zhì)量濃度，μg·kg-1；X實(shí)為標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際質(zhì)量濃度，μg·kg-1；為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，μg·kg-1；a為工作曲線斜率。

3.3.6 原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)不確定度ur(P)

經(jīng)查詢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，F(xiàn)F的純度為99.8%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±1%，k=2，則u(PFF)=0.001/2=0.000 5，ur(PFF)=0.000 5/0.998=0.005 01；FFA的純度為99.2%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±2%，k=2，則u(PFFA)=0.002/2=0.001，ur(PFFA)=0.001/0.992=0.002 01。

3.4 儀器分析引入的相對(duì)不確定度ur(E)

查詢高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀校準(zhǔn)證書知，該儀器的測(cè)量重復(fù)性（RSD）為2%，假設(shè)為均勻分布，則儀器分析引入的相對(duì)不確定度

3.5 回收率測(cè)試隨機(jī)效應(yīng)引入的相對(duì)不確定度ur(R)

對(duì)同一樣品分高中低3個(gè)濃度合計(jì)加標(biāo)9次（n=9），上機(jī)測(cè)得FF、FFA的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表6。根據(jù)公式（5）計(jì)算得到9次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差S(R)，根據(jù)公式（6）和（7）計(jì)算得到回收率測(cè)試過程中引入的相對(duì)不確定度ur(R)，結(jié)果見表6。

表6 ur(R)計(jì)算結(jié)果表

用t檢驗(yàn)對(duì)回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，計(jì)算公式為取P=0.95，查閱t檢驗(yàn)表，t(0.05)=2.57，即當(dāng)t值大于2.57時(shí)，與100%有顯著性差異，必須在計(jì)算公式中采用以修正結(jié)果。計(jì)算FF、FFA的t值分別為7.880、5.334，因此計(jì)算公式均需要代入回收率。

4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

氟苯尼考和氟苯尼考胺的相對(duì)不確定度分量見表7。

表7 氟苯尼考和氟苯尼考胺相對(duì)不確定度分量表

根據(jù)表中各不確定度分量，若不考慮不確定的相關(guān)性，則FF合成不確定度為：

同理，F(xiàn)FA合成不確定度ur(WFFA)=0.080 2。

5 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL006：2018），取包含因子k=2時(shí)（95%置信度），依據(jù)《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》（JJF 1135—2005），擴(kuò)展不確定度UFF=ur(WFF)×2×；UFFA=ur(WFFA)×2×；由此得到動(dòng)物源性食品中FF、FFA的測(cè)定結(jié)果，見表8。

表8 豬肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量不確定度評(píng)定結(jié)果表

6 結(jié)論

本研究應(yīng)用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.5—2021）對(duì)豬肉中氟苯尼考與氟苯尼考胺殘留量進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)數(shù)學(xué)模型對(duì)測(cè)定過程中不確定度各分量進(jìn)行評(píng)定[6]。采用該方法，測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來源于混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備、混標(biāo)中間液的制備、測(cè)量重復(fù)性3個(gè)部分，其中移液槍容量允許差引入的不確定度最顯著。因此，在混標(biāo)梯度工作液的配制過程中應(yīng)當(dāng)選擇經(jīng)過檢定校準(zhǔn)的移液槍，并增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，盡可能減少因移液槍容量允許差引入的不確定度[18]；做好儀器的檢定校準(zhǔn)工作，使儀器保持足夠的精密度與靈敏度；試驗(yàn)應(yīng)采取雙人雙樣檢測(cè)，最大程度減少人為因素導(dǎo)致的偶然誤差對(duì)結(jié)果的影響。