黃瑩瑩 裴浩

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)簡稱舌鱗癌，是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，惡性程度及淋巴結轉移率較高，同時具有很高的發(fā)病率和死亡率[1]。舌鱗癌的發(fā)病原因至今還沒有明確，大量研究認定其發(fā)生與環(huán)境因素有關[2]。在近三十年的臨床治療中形成了以手術為主，放化療為輔的綜合治療體系，然而舌鱗癌的五年生存率仍然處在非常低的水平，主要治療瓶頸卡在化療藥物的選擇上，當前的大部分化療藥物都存在一定的毒副作用，所以很多患者會受到很多的額外困擾[3-4]。魚藤素(deguelin， DEG)是一種豆科植物魚藤屬的毛魚藤根莖部提取出來的擬魚藤酮類藥物，同屬黃酮類化合物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)魚藤素能夠能增加多種腫瘤細胞對化療藥物和放射線的敏感性，具有很強的輔助治療作用；多項體外研究表明魚藤素對肺癌、乳腺癌、消化道癌等多種癌癥產(chǎn)生明顯的抗癌效果[5-8]。但是目前國內(nèi)外對魚藤素的抗癌作用并沒有明確的研究結論。本課題用不同濃度DEG加藥干預TSCC細胞，構建裸鼠移植瘤小鼠模型，探討魚藤素對舌鱗癌細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和動物分組

CAL27細胞(中國科學院細胞研究所); HOK細胞(人正常口腔上皮角質(zhì)細胞)(上海通派生物科技有限公司)，均用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于孵育箱中(37 ℃、 5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗；SPF級BALB/c雌性裸鼠(18～20 g， 5～6 周齡)[動物許可證號: SCXK(京)2016-0006, 北京維通利華實驗動物技術有限公司]。分為空白組、順鉑組、低劑量魚藤素組、中劑量魚藤素組和高劑量魚藤素組，每組6 只。分別用生理鹽水，30 mg/kg順鉑， 10 mg/kg魚藤素，20 mg/kg魚藤素和30 mg/kg魚藤素處理，動物實驗經(jīng)過倫理委員會批準(批號： 2020-xxgnk012)。

1.2 試劑與儀器

順鉑(CAS:15663-27-1，純度≥98%)[華中海威(北京)基因科技有限公司]； DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)； 一抗和二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)； TUNEL試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)； CCK-8試劑盒(南京博研生物科技有限公司)； BCA蛋白濃度測定試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)； ECL發(fā)光試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司)。

CQ-80L二氧化碳培養(yǎng)箱(常州金壇良友儀器有限公司)；匯松酶標分析儀MB-580(濟南歐萊博科學儀器有限公司)；FACSCanto II流式細胞儀(BD有限公司，美國)；Western blot電泳儀及轉膜儀(Bio-Rad公司, 美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8檢測增殖 當細胞滿度約為70%后換液處理，用1% FBS的DMEM孵育2 h，分成空白組、5 μmol/L DEG、 10 μmol/L DEG、 20 μmol/L DEG、 30 μmol/L DEG、 40 μmol/L DEG及50 μmol/L 8 組進行加藥處理，設置相同濃度的順鉑組實驗。24 h后加入15 μL CCK-8溶液， 490 nm波長重復3 次測量吸光度值，計算細胞存活率和半數(shù)致死濃度(IC50值)。

1.3.2 Hochest/PI雙染檢測細胞凋亡 選擇恰好處于對數(shù)生長期的CAL27細胞接種于六孔板中，待細胞密度達到75%左右時，加入不同濃度的魚藤素(5、10、30及50 μmol/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入Hochest/PI染色劑，隨后通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，并對其進行拍照記錄。

1.3.3 流式細胞術法檢測細胞凋亡 將CAL27細胞接種至6 孔板，過夜培養(yǎng)。按濃度為IC50的DEG分別處理CAL27細胞3、 6、12和24 h，隨后收集細胞于Tube管中， 5 000 r/min離心4～5 min，舍去上層清液，按照試劑盒說明書將1×結合緩沖液、Annexin V-FITC及PI染料以195∶3∶2重懸細胞將細胞染色，流式細胞儀上機檢測凋亡細胞比例。

1.3.4 流式細胞術檢測活性氧(ROS)水平變化 用IC50值為終濃度的DEG分別處理細胞3、 6、 12和24 h后，將細胞收集到Tube管中，PBS清洗并重懸，加入5 μL DCFH-DA并置于37 ℃ 恒溫水浴鍋中避光孵育0.5 h，離心后用PBS重懸洗滌1 次， 500 μL PBS重懸細胞后流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平。隨后進一步檢測加入ROS清除劑NAC之后DEG對CAL27細胞凋亡變化情況。

1.3.5 構建裸鼠移植瘤模型及分組藥物處理 將細胞密度為2×107/mL的CAL27以5×106個細胞/只的濃度以腋下接種的方式注入到裸鼠皮下，注入細胞后用指肚輕輕按壓注射的位置，每天觀察裸鼠及腫瘤狀況。當接種裸鼠均出現(xiàn)直徑大5 mm3的皮下質(zhì)硬結節(jié)時，將30 只荷瘤鼠根據(jù)分組的實驗方案，灌胃給藥，每兩天一次并持續(xù)4 周，停藥后犧牲裸鼠并剝離腫瘤。

1.3.6 對裸鼠瘤小鼠腫瘤體積及重量的測定 隔2 d用游標卡尺測量瘤體，通過公式V=1/2×長徑×短徑2計算瘤體體積；實驗周期完成后剝離腫瘤，記錄瘤體質(zhì)量；腫瘤抑制率計算公式為：(空白對照組瘤重均值-實驗組瘤重均值)/空白組對照瘤重均值×100%。

1.3.7 檢測組織中的凋亡細胞狀況 OTC包埋組織，調(diào)整切片機厚度為4 μm連續(xù)切片，并參照TUNEL檢測試劑盒說明書對腫瘤組織中的細胞凋亡情況進行檢測。在400 倍的光學顯微鏡下觀察計數(shù)， 細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/腫瘤細胞總數(shù)。

1.3.8 Western blot檢測相關蛋白變化 利用超聲波破碎儀將組織中的蛋白裂解出來，在4 ℃離心機中離心后取上清蛋白配樣，將蛋白通過10%～15%的SDS-PAGE凝膠分離，然后將凝膠轉移至NC膜表層，將NC膜用脫脂乳封閉2 h。隨后用PBS洗去脫脂乳浮液，然后一抗加入NC膜上4 ℃過夜，TBST洗膜，隨后二抗室溫孵育2 h， ECL顯色，再通過化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照、 ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 CCK-8實驗檢測CAL27細胞的增殖情況

從表 1中可以看出，隨著魚藤素處理濃度的不斷提升細胞存活率逐漸降低，具有明顯的濃度依賴性，當50 μmol/L DEG處理24 h時，細胞存活率僅為14.6%±3.3%，經(jīng)計算IC50為17.8 μmol/L；對正?？谇簧掀ぜ毎臋z測結果顯示，魚藤素對正常細胞的毒副作用較小，當50 μmol/L DEG處理24 h時，細胞存活率為81.3%±1.9%。

表 1 魚藤素對CAL27細胞和HOK細胞的增殖抑制作用

2.2 魚藤素對舌鱗癌CAL27細胞的誘導凋亡作用

魚藤素對CAL 27細胞形態(tài)的影響如圖 1，當處理濃度較小時，CAL27細胞體積有所增大，細胞密度逐漸變得稀疏；處理濃度增大后，CAL27細胞大量漂浮，細胞間隙明顯增大。在熒光條件下，CAL27細胞的紅色熒光強度隨著魚藤素的處理時間逐漸增強，說明細胞出現(xiàn)凋亡。流式細胞術的結果如圖 2，魚藤素處理6 h后，細胞開始出現(xiàn)明顯的凋亡，并且在處理24 h時，凋亡細胞比例達到最高57.5%±3.2%。同時凋亡相關蛋白檢測結果如圖 3，Caspase-9和pro-caspase-3表達量降低，cleaved-caspase-3表達量升高。

圖 1 魚藤素對CAL27細胞的誘導凋亡作用

圖 2 CAL27細胞凋亡流式細胞術檢測結果

圖 3 CAL27細胞中凋亡相關蛋白的表達

2.3 魚藤素對舌鱗癌CAL27細胞的ROS調(diào)控作用

為了探究魚藤素誘導CAL27細胞發(fā)生凋亡是否與細胞內(nèi)活性氧水平有關， 以IC50濃度的魚藤素處理CAL27細胞不同時間(3、 6、 12及24 h)后，加入DCFH-DA熒光探針， 并通過流式細胞術檢測細胞內(nèi)活性氧水平變化情況。從圖 4中可以看出，隨著魚藤素處理時間的不斷增加，CAL27細胞中ROS水平呈現(xiàn)時間依賴性逐漸升高。在魚藤素處理后再加入ROS清除劑NAC后，細胞凋亡情況被明顯抑制，與魚藤素處理組相比具有顯著性差異(圖 5)。

圖 4 魚藤素增強CAL27細胞的ROS水平

圖 5 DEG和NAC對CAL27細胞凋亡的影響

2.4 魚藤素上調(diào)ROS水平調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路

Western blot結果如圖 6,魚藤素處理組的PI3K和p-AKT的表達量降低，但是當魚藤素和NAC共同處理后，PI3K和p-AKT的表達量升高，基本恢復到與對照組相近的水平，說明ROS處于PI3K/AKT通路的上游。

圖 6 魚藤素通過調(diào)節(jié)ROS水平來抑制PI3K/AKT信號通路

2.5 魚藤素抑制舌鱗癌裸鼠移植瘤生長

與對照組相比， 裸鼠移植瘤的瘤體積隨著DEG劑量的加大而明顯減小(P<0.05)，平均瘤重明顯減輕(P<0.05)(圖 7)。TUNEL實驗結果顯示(圖 7)，隨著魚藤素處理劑量的不斷增加，凋亡細胞數(shù)量逐漸增加，具有一定的濃度依賴性(圖 7)。經(jīng)計算，DEG低、中、高劑量組腫瘤抑制率和瘤重如表 2，分別為20.1%， 56.1%和72.6%，與相同濃度的順鉑相比， DEG的腫瘤抑制效果要更強(P<0.05)，表明魚藤素能夠在一定范圍內(nèi)以濃度梯度來抑制體內(nèi)腫瘤的生長。

圖 7 DEG促進裸鼠移植瘤中細胞凋亡

表 2 DEG對裸鼠移植瘤抑制率的影響

3 討 論

舌鱗癌患者的五年生存率近年來一直徘徊在50%左右，這一數(shù)字在晚期患者的身上則降為25%，已經(jīng)嚴重危害了人類的健康和生存[9]。傳統(tǒng)的治療手段中化療特異性低，毒副作用較大，所以尋找更安全有效的化療藥物是提高舌鱗癌患者生存率和生存質(zhì)量的重點。魚藤素是近年來被發(fā)現(xiàn)的Akt特異性抑制劑，對多種癌癥均具有很強的抗癌效果，有研究顯示，魚藤素發(fā)揮作用主要是通過抑制前列腺癌、肺癌及乳腺癌等多種癌細胞的Akt(Thr308)、PTEN(Ser380)和PDK1(Ser241)的磷酸化有關，但是其上游的調(diào)控機制是如何進行的還尚不明確[10-11]。本研究首先驗證了魚藤素對舌鱗癌CAL27細胞的增殖抑制作用，可以看出魚藤素能夠以濃度依賴性的方式抑制CAL27細胞增殖，與陽性對照藥物順鉑相比，魚藤素的增殖抑制效果要更強。同時驗證其對正常細胞的毒副作用發(fā)現(xiàn)，魚藤素對人正?？谇簧掀そ琴|(zhì)HOK細胞的毒副作用要低于順鉑。經(jīng)計算，魚藤素對舌鱗癌CAL27細胞的半數(shù)致死濃度(IC50)為17.8 μmol/L，這也與文獻報道的對其他癌癥的半數(shù)致死濃度在相近的范圍內(nèi)。

雖然臨床上常用的化療藥物具體的作用機制不盡相同，但是都有一個相同的“目的”——誘導癌細胞凋亡，以誘導細胞凋亡為方向來開發(fā)抗化療藥物已經(jīng)逐漸被認可，并發(fā)展成為腫瘤治療研究中的新熱點[12]。在凋亡過程中可以在顯微鏡下觀察到細胞體積縮小，結構更加緊密，胞膜不斷出芽、脫落，細胞變成數(shù)個大小不等的凋亡小體。Caspase-3和Caspase-9蛋白在各類癌的發(fā)生、發(fā)展中都起著十分重要作用[13]。在凋亡過程中，pro-caspase-3會被剪切成具有執(zhí)行功能的cleaved-caspase-3執(zhí)行凋亡“任務”。本研究雙染實驗結果可以初步看出，魚藤素能夠改變CAL27細胞形態(tài)，隨后的流式細胞術進一步證明了魚藤素能夠誘導CAL27細胞發(fā)生細胞凋亡，并進行了Western blot實驗檢測凋亡相關蛋白的表達，從分子水平上證明了魚藤素的誘導凋亡能力。

當癌細胞中的ROS水平過高后會直接調(diào)控細胞中的多條信號通路及多個信號因子，細胞中的多種生理進程會因此而改變，其中就包括細胞凋亡[14]。在魚藤素處理后，CAL27細胞中的活性氧水平逐漸升高，并且具有明顯的時間依賴性，為了驗證ROS水平上升是否和凋亡有關，加入了NAC后繼續(xù)檢測細胞凋亡情況，可以看出NAC大幅降低了魚藤素誘導的細胞凋亡比例。PI3K/AKT通路是一條經(jīng)典的信號通路，魚藤素被認為是Akt抑制劑，但是魚藤素是怎樣調(diào)控Akt信號通路的還尚不明確，在查閱了大量文獻后得知ROS可以直接調(diào)控Akt的磷酸化，進而調(diào)控整條PI3K/AKT信號通路[15-16]。所以為了驗證魚藤素是否是通過上調(diào)ROS水平來實現(xiàn)對Akt通路的抑制的，加入NAC檢測Akt通路蛋白的表達，可以看出魚藤素和NAC共同處理組的p-Akt和PI3K表達量要遠高于魚藤素單獨處理組，說明調(diào)控ROS水平是魚藤素發(fā)揮Akt抑制劑作用的關鍵要素。

體內(nèi)裸鼠瘤實驗是驗證藥效和檢測毒副作用的關鍵，有研究表明30 mg/kg順鉑對大部分瘤體的生長抑制較強，因此本研究同樣選取了30 mg/kg順鉑為陽性對照組。從結果中可以看出魚藤素能夠抑制裸鼠移植瘤的生長，并且具有一定的濃度依賴性，相同濃度下對瘤體的抑制效果要強于順鉑，30 mg/kg的魚藤素對瘤體的抑制率高達72.6%，并且在實驗過程中，小鼠沒有死亡，體重也沒有明顯的變化，說明魚藤素的體內(nèi)毒副作用較小。

綜上所述，Akt抑制劑魚藤素對舌鱗癌細胞具有很強的抑制增殖作用，其作用機制是通過上調(diào)細胞中ROS水平，進而抑制PI3K/Akt信號通路，最終引起舌鱗癌細胞發(fā)生凋亡，為中藥魚藤素在舌鱗癌中的應用提供了一定的基礎。