岑思恩 焦春偉* 隨晶晶 陳家明 謝意珍，2

（1廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510663；2廣東粵微生物科技有限公司，廣東廣州510663）

鐵皮石斛Dendrobium officinale，是蘭科石斛屬多年生草本植物，其活性成分包括多糖、生物堿、黃酮、揮發(fā)油等；具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、降尿酸、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等藥理作用[1-3]。由于野生鐵皮石斛數(shù)量較少，價(jià)格昂貴，故目前鐵皮石斛相關(guān)產(chǎn)品多是復(fù)方制劑。鐵皮石斛通常與西洋參、靈芝、枸杞配伍使用。檢索國家市場監(jiān)督管理總局特殊食品信息查詢平臺(tái)，截至2022 年1 月，獲批準(zhǔn)的以鐵皮石斛為原料的保健食品共129 款，其中鐵皮石斛與靈芝配伍使用產(chǎn)品共11款，配伍頻次僅低于西洋參，且獲批功能均為增強(qiáng)免疫力，可見鐵皮石斛與靈芝復(fù)配具有增強(qiáng)免疫力功效，已獲得專家及市場的一致認(rèn)可。靈芝Ganoderma lucidum，是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，靈芝孢子（Sporoderm-Broken Spore ofGanoderma lucidum）是靈芝成熟期釋放出的卵型生殖細(xì)胞，富含多糖、三萜和核苷等多種功效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4-6]。靈芝孢子中部分活性物質(zhì)如總?cè)?、總多糖含量明顯高于靈芝子實(shí)體，同時(shí)在抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等方面表現(xiàn)出更加明顯的效果[7]。因靈芝孢子具有堅(jiān)硬的孢壁，孢子內(nèi)有效成分難以通過孢壁溶出而被人體吸收利用，其開發(fā)和應(yīng)用受到限制。得益于現(xiàn)代工藝的發(fā)展，通過破壁技術(shù)可有效地將孢壁打碎，使活性成分更易釋放，從而破壁靈芝孢子逐漸受到市場的關(guān)注[8-9]。

破壁靈芝孢子及鐵皮石斛同屬補(bǔ)益藥，有良好的保健食品開發(fā)前景。隨著中藥化學(xué)和藥理學(xué)的發(fā)展，多項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)和人群試驗(yàn)已驗(yàn)證了破壁靈芝孢子粉及鐵皮石斛都具有増強(qiáng)免疫功能的作用[10-15]。目前，已有針對破壁靈芝孢子粉或鐵皮石斛單味中藥進(jìn)行深入而細(xì)致的研究，但對于破壁靈芝孢子及鐵皮石斛復(fù)配組方的免疫功能的研究鮮有報(bào)道。破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉是以破壁靈芝孢子和鐵皮石斛組成的復(fù)方制劑，筆者參考衛(wèi)生與健康委員會(huì)（原衛(wèi)生部）《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003 年版）[16]對其增強(qiáng)免疫力作用進(jìn)行研究，為其推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）試驗(yàn)樣品：破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉樣品由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供，由鐵皮石斛經(jīng)滅菌、干燥、粉碎后，與破壁靈芝孢子粉混合而成。樣品含粗多糖6%（硫酸-苯酚法）及總?cè)?%（香草醛-冰醋酸顯色法）。人體每日推薦食用量為2 g。試驗(yàn)前將樣品用純凈水配制成各劑量。

（2）試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明種健康小鼠，體重18~22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（粵）2013-0002，飼料由廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于廣東省疾病預(yù)防控制中心屏障環(huán)境中，使用許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0011，飼養(yǎng)環(huán)境條件為室溫20~26 ℃，空氣相對濕度40%~70%。

（3）儀器與試劑：CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，HERAcell 240i]，CASY 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（德國Innovatis 公司，CASY-DT），酶標(biāo)儀（美谷分子儀器（上海）有限公司，SOFTmaxPRO），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2F），分光光度計(jì)（日本島津公司，UV-2550），倒置顯微鏡（上海徠卡顯微鏡有限公司，XDP-12），顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，CX31），游標(biāo)卡尺，RPMI1640 培養(yǎng)基，綿羊紅細(xì)胞，MTT和ConA等。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)室條件下檢疫3 d 后，隨機(jī)分為4 批，每批40 只。第1 批用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和血清溶血素測定；第2 批用于脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞抗體生成試驗(yàn)及NK 細(xì)胞活性試驗(yàn)；第3 批用于碳廓清試驗(yàn)；第4 批用于腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。

每批動(dòng)物隨機(jī)分為低、中、高3個(gè)劑量組及陰性對照組，每組10 只小鼠。低、中、高劑量分別為0.17 g/（kg BW）、0.33 g/（kg BW）、1.00 g/（kg BW）（相當(dāng)于人體日推薦量的5 倍、10 倍、30 倍），每天按0.2 mL/10 g BW 量灌胃給樣，陰性對照組灌胃同等的純凈水。給樣量根據(jù)每周體重增減調(diào)整，試驗(yàn)周期為4周。

參考衛(wèi)生與健康委員會(huì)（原衛(wèi)生部）《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003 年版）[16]的方法進(jìn)行臟器指數(shù)的測定、ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）、抗體生成細(xì)胞檢測（Jerne 改良玻片法）、血清溶血素的測定（半數(shù)溶血值法）、小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)（滴片法）、NK細(xì)胞活性測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠臟器指數(shù)的影響

胸腺是T 淋巴細(xì)胞分化成熟的部位，脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官[17]，免疫功能低下時(shí)胸腺、脾臟萎縮，體積變小[18]。因此，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是表征機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。由表1 可知，各劑量組小鼠的臟器/體重比值與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無明顯影響。

表1 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果（±s，n=10）

表1 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果（±s，n=10）

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2.2 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)屬于IV 型變態(tài)反應(yīng)，其組織損傷機(jī)制是由特異性致敏T 細(xì)胞所介導(dǎo)，體現(xiàn)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能[19]。由表2 可知，與陰性對照組比較，各劑量組小鼠的足跖增厚值均升高，中、高劑量組足跖增厚值具有顯著性差異（P＜0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉具有促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用。

表2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

表2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

注：*表示與陰性對照組比差異顯著，P＜0.05。

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2.3 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的影響

脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是反映機(jī)體細(xì)胞免疫的基本指標(biāo)，通過檢測淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率可以了解試樣對機(jī)體免疫功能的影響[20]。當(dāng)T 淋巴細(xì)胞受ConA 刺激后發(fā)生增殖反應(yīng)，增殖細(xì)胞中的線粒體水解酶可將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解成紫色結(jié)晶，通過測定光密度值能反應(yīng)細(xì)胞增殖情況[16]。由表3 可知，各劑量組光密度差值與陰性對照組比較，差異均無顯著性意義（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力無影響。

表3 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

表3 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

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2.4 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對血清溶血素的影響

血清溶血素是B淋巴細(xì)胞接觸紅細(xì)胞后產(chǎn)生的特異性抗體，接觸特異性抗原綿羊紅細(xì)胞后，其水平反映機(jī)體釋放特異性抗體的能力，能夠評(píng)價(jià)體液免疫功能的狀態(tài)[21]。由表4 可知，各劑量組小鼠的半數(shù)溶血值均高于陰性對照組，且中劑量組與陰性對照組的差異顯著（P＜0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉具有提高小鼠血清溶血素水平的作用。

表4 小鼠血清溶血素測定結(jié)果（±s，n=10）

表4 小鼠血清溶血素測定結(jié)果（±s，n=10）

注：*表示與陰性對照組相比差異顯著，P＜0.05。

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2.5 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠脾淋巴細(xì)胞抗體生成水平的影響

抗體生成細(xì)胞由B 淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生，能產(chǎn)生各種免疫球蛋白，介導(dǎo)體液免疫[22]。由表5 可知，各劑量組的溶血空斑數(shù)與陰性對照組比較，差異均無顯著性（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠脾淋巴細(xì)胞抗體生成水平無影響。

表5 抗體生成水平測定結(jié)果（±s，n=10）

表5 抗體生成水平測定結(jié)果（±s，n=10）

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2.6 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠碳廓清吞噬功能的影響

單核巨噬細(xì)胞吞噬能力是評(píng)價(jià)非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，其經(jīng)典的試驗(yàn)方法為碳廓清法[23]。當(dāng)印度墨汁中的顆粒狀異物注入血液后，大部分異物迅速被肝臟和脾臟中的巨噬細(xì)胞所吞噬。碳廓清試驗(yàn)中測得的碳廓清指數(shù)可以反映碳粒的清除速率，吞噬系數(shù)反映的是每單位量的組織吞噬活性[24]。由表6可知，各劑量組的碳廓清吞噬指數(shù)均高于陰性對照組，且中、高劑量與陰性對照組有顯著性差異（P＜0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉具有促進(jìn)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞碳廓清功能的作用。

表6 小鼠碳廓清試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

表6 小鼠碳廓清試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

注：*表示與陰性對照組相比差異顯著，P＜0.05。

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2.7 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的影響

巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的吞噬殺傷能力，是參與機(jī)體非特異性免疫防御的重要免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞最突出的作用是清除受傷后的組織碎片和發(fā)育過程中的凋亡細(xì)胞，消滅入侵的病原體，是機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制之一[25]。利用巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)可以在體外觀察巨噬細(xì)胞的吞噬功能。由表7 可知，各劑量組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬百分率轉(zhuǎn)換值及吞噬指數(shù)指標(biāo)與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力無影響。

表7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

表7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

注：吞噬百分率轉(zhuǎn)換值X=Sin-1（p）1/2。

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2.8 破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠NK 細(xì)胞活性的影響

NK 細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有免疫清除和免疫監(jiān)視的功能。只有活化的NK 細(xì)胞才能擴(kuò)散、浸潤至感染源，故NK 細(xì)胞活性是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)[26]。由表8 可知，各劑量組小鼠的NK 細(xì)胞活性與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05），表明破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉對小鼠NK細(xì)胞活性無影響。

表8 小鼠NK細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

表8 小鼠NK細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

注：NK細(xì)胞活性轉(zhuǎn)換值X=Sin-1（p）1/2。

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3 小結(jié)與討論

采用遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、血清溶血素測定、脾淋巴細(xì)胞抗體生成試驗(yàn)、碳廓清試驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、NK 細(xì)胞活性測定等，研究破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉的增強(qiáng)免疫力作用。結(jié)果表明，破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉可增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，提高血清溶血素半數(shù)溶血值及碳廓清吞噬指數(shù)。由此可判定，破壁靈芝孢子鐵皮石斛粉可顯著增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能及單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能，具有明確的增強(qiáng)免疫力作用。