陳葉玲，謝 馨，李 卉，羅凱燕

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430022

骨肉瘤是一種來(lái)源于成骨間充質(zhì)干細(xì)胞的原發(fā)性惡性腫瘤，主要累及兒童和青少年的長(zhǎng)骨干骺端區(qū)域部分[1-2]。隨著順鉑、多柔比星和大劑量甲氨蝶呤等輔助化療的出現(xiàn)及手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步，骨肉瘤的臨床療效得到明顯改善，但仍有近三分之一的局限性骨肉瘤患者在診斷后兩年內(nèi)復(fù)發(fā)，以肺部轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)(5年存活率<20%)[3-4]。因此，尋找新的預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)，減少骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，提高其生存率已成為當(dāng)務(wù)之急。有研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)家族可通過(guò)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)關(guān)鍵的生理、病理學(xué)過(guò)程(如細(xì)胞信號(hào)傳遞、炎癥反應(yīng)、有絲分裂發(fā)生等)，在惡性腫瘤細(xì)胞中，ROS代謝物可作為信號(hào)分子，可促進(jìn)細(xì)胞存活[5]。NOX 酶和線粒體是細(xì)胞ROS的主要來(lái)源。然而，臨床對(duì)NOX家族在人類癌癥發(fā)生和發(fā)展中作用了解仍然有限[6]。本研究通過(guò)分析兒童/青少年骨肉瘤組織NOX2蛋白表達(dá)與臨床病理特征、新輔助化療后局部病變進(jìn)展情況，為明確NOX2能否成為骨肉瘤治療的潛在生物學(xué)靶標(biāo)提供證據(jù)支持?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析自2005年1月至2016年12月收治的134例局限性(非轉(zhuǎn)移性)原發(fā)性骨肉瘤患兒的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤18歲；(2)確診為局限性(非轉(zhuǎn)移性)原發(fā)性骨肉瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)未接受新輔助化療或臨床信息不可用；(2)中途轉(zhuǎn)院或任何原因停止治療。所有患兒均接受新輔助化療(多柔比星和甲氨蝶呤聯(lián)合治療)后行手術(shù)切除。根據(jù)Huvos分級(jí)系統(tǒng)評(píng)估腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)。新輔助化療后腫瘤壞死率≥90%被歸類為病理反應(yīng)良好，否則為病理反應(yīng)不良。選取同期醫(yī)院收治的53例多指畸形患兒的軟骨組織樣本作為參考組。參考組男性30例,女性23例；年齡(12.74±3.95)歲。骨肉瘤組男性69例,女性65例；年齡(11.06±4.13)歲。兩組患兒的年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，有可比性。參加本研究的患兒法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2 檢測(cè)組織NOX2蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical method，IHC)使用PV9000免疫組化試劑盒(Origene Technologies，中國(guó))對(duì)所有患兒組織樣本NOX2表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。將樣本制成4 mm厚連續(xù)切片，60℃孵育1 h，脫蠟脫水，室溫下使用3%過(guò)氧化氫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。將切片在檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中微波2 min，以恢復(fù)抗原，自然冷卻至室溫。使用NOX2抗體(兔單克隆抗體，1:100稀釋，Abclonal，美國(guó))，37℃孵育1～2 h，室溫下過(guò)氧物酶-抗兔免疫球蛋白G(Origene Technologies，中國(guó))孵育20 min。切片使用二氨基聯(lián)苯胺(Origene Technologies，中國(guó))進(jìn)行3～5 min染色，再于室溫下使用蘇木精復(fù)染2 min，脫水。所有樣本均使用蘇木精-伊紅染色識(shí)別腫瘤部位。染色結(jié)果由2名病理學(xué)專家進(jìn)行評(píng)估，染色程度<10%為0分，10%～25%為1分，25%～70%為2分，染色程度>70%為3分，評(píng)分≤2分為低表達(dá)，評(píng)分>2分為高表達(dá)。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織NOX2蛋白表達(dá) 使用裂解緩沖液(Beyotime Biotechnology，中國(guó))提取蛋白，并采用Pierce Bicinchoninic Acid蛋白檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))進(jìn)行定量檢測(cè)。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，New Cell & Molecular Biotech，中國(guó))用于分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Merck Millipore，德國(guó))上。用牛血清白蛋白(Beyotime Biotechnology，中國(guó))封閉膜1 h，然后與抗NOX2(Abclonal，美國(guó))和微管蛋白抗體(Affinity，美國(guó))在4℃下孵育過(guò)夜?？筃OX2膜與山羊抗兔單克隆二抗(Affinity，美國(guó))、微管蛋白膜及目標(biāo)抗兔多克隆二抗體(Affinity，美國(guó))在37℃孵育1 h。使用Enhanced Chemiluminescent(New Cell & Molecular Biotech，中國(guó))、FluorChem R檢測(cè)系統(tǒng)(ProteinSimple，美國(guó))和Image Lab 3.0軟件(Bio-Rad Laboratories，美國(guó))對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.3 隨訪觀察 為評(píng)估患兒5年內(nèi)局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的進(jìn)展情況，所有患兒在治療后的5年內(nèi)，每3個(gè)月進(jìn)行一次X線或CT掃描，3年后每6個(gè)月進(jìn)行一次CT掃描。由2名放射科醫(yī)師在不知患者預(yù)后的前提下，獨(dú)立回顧分析從診斷到新輔助化療的原發(fā)腫瘤灶MRI掃描圖像，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度、寬度和深度。判斷是否有局部疾病進(jìn)展(local progressive disease，L-PD)[7]。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間定義為從診斷之日到腫瘤首次進(jìn)展或最后一次隨訪的時(shí)間間隔，總生存時(shí)間定義為從診斷到死亡甚至最后一次隨訪的時(shí)間間隔。如果未發(fā)生腫瘤進(jìn)展或死亡，則在最后一次隨訪時(shí)對(duì)患者進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 2組患兒組織NOX2蛋白表達(dá)情況 經(jīng)IHC分析，骨肉瘤組NOX2蛋白高表達(dá)率高于參考組[33.6%(45/134) vs.13.2%(7/53)],骨肉瘤組腫瘤組織NOX2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于參考組[0.505(0.277，0.838)vs.0.367(0.281，0.499)],差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)ROC曲線分析，組織NOX2蛋白相對(duì)表達(dá)量用于診斷骨肉瘤的AUC為0.746。見(jiàn)圖1。經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，IHC結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果具有相關(guān)性(P<0.001)。

圖1 組織NOX2蛋白相對(duì)表達(dá)量用于診斷骨肉瘤ROC曲線

2.2 不同程度NOX2蛋白表達(dá)骨肉瘤患兒相關(guān)指標(biāo)比較 根據(jù)IHC法檢測(cè)的組織NOX2蛋白表達(dá)狀態(tài)分為低表達(dá)組(n=89)與高表達(dá)組(n=45)。結(jié)果顯示，高表達(dá)組病灶數(shù)目≥5個(gè)及新輔助化療反應(yīng)不良的患兒比例高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同程度NOX2蛋白表達(dá)骨肉瘤患兒相關(guān)指標(biāo)比較/例(百分率/%)

2.3 單因素和多因素分析影響5年L-PD預(yù)后的臨床因素 隨訪期內(nèi)發(fā)生L-PD的患兒有34例。Kaplan-meier生存曲線結(jié)果顯示，組織NOX2高表達(dá)者5年無(wú)L-PD時(shí)間短于低表達(dá)者(χ2=6.204，P<0.001，圖2)。單因素及多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，組織NOX2蛋白高表達(dá)是骨肉瘤患兒5年L-PD預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.001)。見(jiàn)表2。

圖2 組織NOX2蛋白表達(dá)狀態(tài)與骨肉瘤患兒生存時(shí)間的Kaplan-Meier生存曲線

表2 單因素及多因素COX回歸模型分析影響骨肉瘤患兒5年L-PD預(yù)后的預(yù)測(cè)因素

2.4 ROC曲線分析組織NOX2蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)骨肉瘤患兒新輔助化療反應(yīng)及L-PD的臨床效能 經(jīng)ROC曲線分析，組織NOX2蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)骨肉瘤患兒新輔助化療反應(yīng)不良及L-PD的AUC分別為0.774(95%可信區(qū)間0.693～0.855)、0.774(95%可信區(qū)間0.678～0.870)。見(jiàn)表3、圖3。

表3 組織NOX2蛋白表達(dá)對(duì)骨肉瘤患兒新輔助化療反應(yīng)及L-PD預(yù)測(cè)價(jià)值分析

圖3 組織NOX2蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)骨肉瘤患兒新輔助化療反應(yīng)及L-PD的ROC曲線(a.新輔助化療反應(yīng)不良；b.預(yù)測(cè)L-PD)

3 討論

骨肉瘤是較常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，是高度侵襲性腫瘤，易轉(zhuǎn)移至肺部。轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的5年存活率僅有15%～30%，對(duì)于可以完全切除的局限性骨肉瘤，5年存活率僅提高至70%[8-9]。因此，臨床仍迫切需要尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)治療后局部病變進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，組織NOX2蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)骨肉瘤患兒L-PD有很好的效能。NOX是一種用以介導(dǎo)電子跨膜運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)，參與激酶磷酸化，分布廣泛，在胸腺、脾、小腸、胰腺等器官及非吞噬細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)[5]。NOX酶的作用是觸發(fā)適應(yīng)機(jī)制以響應(yīng)壓力、環(huán)境攻擊或其他有害刺激，其對(duì)入侵微生物造成直接損害的作用可以被認(rèn)為是利用ROS破壞入侵微生物大分子能力的應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)子類。ROS在先天免疫中的其他適應(yīng)性作用也符合這一范式，但NOX產(chǎn)生的ROS也可直接損傷宿主組織，從而引發(fā)進(jìn)一步組織損傷的過(guò)度炎癥反應(yīng)，造成改變細(xì)胞凋亡和分化程序等長(zhǎng)期變化。其中，NOX2衍生的ROS被認(rèn)為在發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10-11]。已有眾多生物標(biāo)志物被證實(shí)是通過(guò)調(diào)節(jié)ROS來(lái)影響骨肉瘤的疾病進(jìn)展。CYT997可通過(guò)ROS和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑顯著增加細(xì)胞凋亡和自噬，并且CYT997誘導(dǎo)的ROS和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互增強(qiáng)[12]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA THAP9-AS1通過(guò)減少ROS和通過(guò)SOCS3/JAK2/STAT3通路增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的線粒體膜電位來(lái)降低氧化應(yīng)激，且其穩(wěn)定過(guò)表達(dá)有助于體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。Withaferin-A通過(guò)ROS介導(dǎo)的線粒體膜電位降低和caspase-3激活誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡[14]。本研究骨肉瘤組的組織NOX2蛋白表達(dá)顯著高于參考組，表明NOX2在骨肉瘤組織中存在差異表達(dá)，組織NOX2蛋白表達(dá)還與骨肉瘤患兒的病灶數(shù)目及新輔助化療反應(yīng)相關(guān)，可以說(shuō)明NOX2與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定相關(guān)性。

NOX2已被證實(shí)參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如NOX2 mRNA在人炎癥性腸病結(jié)腸組織中的表達(dá)量顯著更高，是患者自身正常結(jié)腸組的2倍[15]。SARS-CoV-2感染可能引起小膠質(zhì)細(xì)胞中NOX2活化，從而激活通過(guò)釋放氧化化合物和促炎細(xì)胞因子放大炎癥過(guò)程[16]。髓系細(xì)胞NOX2形成的ROS對(duì)于吞噬微生物的破壞至關(guān)重要。有研究表明，由惡性微環(huán)境中的NOX2+骨髓細(xì)胞形成的ROS發(fā)揮與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散相關(guān)的多種作用；腫瘤浸潤(rùn)性髓系細(xì)胞和NOX2+白血病骨髓細(xì)胞可能通過(guò)產(chǎn)生ROS損害相鄰細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的功能和活力，包括自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞、氧化DNA以觸發(fā)促癌體細(xì)胞突變或影響氧化還原平衡在癌細(xì)胞中控制其增殖和存活[17-18]。有研究表明，NOX2的表達(dá)狀態(tài)與骨肉瘤患者的預(yù)后結(jié)局相關(guān)[19]。本研究針對(duì)年齡≤18歲的骨肉瘤患兒進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織NOX2高表達(dá)確實(shí)影響患兒預(yù)后，有預(yù)測(cè)骨肉瘤患兒L-PD及新輔助化療反應(yīng)的效能。

綜上所述，NOX2在骨肉瘤組織組織中呈高表達(dá)，且與病灶數(shù)目增多相關(guān)。NOX2表達(dá)對(duì)骨肉瘤患兒新輔助化療不良及L-PD具有良好的預(yù)測(cè)效能，NOX2有可能成為局限性骨髓瘤患兒新輔助化療療效及預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。