鄭萍萍，王小紅

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 福建福州 350122

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 福建福州 350004

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMT）是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮體以外的部位生長(zhǎng)，主要癥狀為進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)異常以及性交痛，嚴(yán)重影響婦女的生活質(zhì)量和身心健康[1]。其發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，多數(shù)學(xué)者認(rèn)可郎景和教授的內(nèi)膜細(xì)胞要完成黏附（Attachment）-侵襲（Aggression）-血管形成（Angiogenesis）的“AAA”發(fā)病模式[2]。血管生成是其中的重要環(huán)節(jié)。研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是目前具有最強(qiáng)促血管生長(zhǎng)作用的因子，在新生血管生成過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[3，4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“瘀阻胞宮”是EMT的基本病機(jī)[5]，研究表明，VEGF與EMT血瘀證關(guān)系密切，活血化瘀藥物可有效降低EMT患者的血管生成因子水平，抑制異位內(nèi)膜的發(fā)生發(fā)展，從而減輕患者的相關(guān)臨床癥狀[6-8]。但中醫(yī)界大多局限于藥物研究、臨床療效分析及動(dòng)物模型研究；而EMT血瘀證的相關(guān)分子機(jī)制及中醫(yī)學(xué)現(xiàn)代基礎(chǔ)機(jī)制研究缺乏。本文通過檢測(cè)VEGF在EMT患者血清及異位內(nèi)膜中的表達(dá)，并分析其與EMT血瘀證患者血瘀積分的相關(guān)性，以期為臨床EMT的中醫(yī)診治提供和補(bǔ)充現(xiàn)代基礎(chǔ)理論的支持和依據(jù)。

資料與方法

1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照第9版婦產(chǎn)科學(xué)[1]及2015年子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南[9]。

1.2 血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn) 采集的患者的臨床表現(xiàn)，將所得信息錄入“中醫(yī)健康狀態(tài)辨識(shí)系統(tǒng)”進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化辨證，參照朱文鋒《證素辨證學(xué)》進(jìn)行診斷[10]。并通過加權(quán)閾值的方法，計(jì)算證素積分及分級(jí)，見表1。

表1 血瘀證素積分分級(jí)

2 入組標(biāo)準(zhǔn)

2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 均經(jīng)術(shù)后病理確診且證素辨證屬血瘀證；月經(jīng)規(guī)律，且術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未使用激素類藥物治療者；同意參加本次課題研究并簽署知情同意書。

2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)或術(shù)前3個(gè)月使用激素類藥物者；子宮內(nèi)膜病變、癌前病變及惡性腫瘤患者；近期皮膚有燙傷、燒傷、挫傷等大面積損傷，可能影響研究結(jié)果的病史者。

3 一般資料

選取2020年1月-2021年1月于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦科病房住院的患者120例，實(shí)驗(yàn)組為術(shù)前證素辨證為血瘀證，行腹腔鏡手術(shù)術(shù)后病理確診EMT的患者60例；對(duì)照組為術(shù)前證素辨證為血瘀證，行腹腔鏡切除子宮術(shù)后病理診斷排除EMT及子宮腺肌病的患者60例。2組的年齡，血瘀積分及血瘀分級(jí)等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2組具有可比性。見表2。

表2 2組一般資料比較

4 研究方法

4.1 標(biāo)本的采集及保存 血清：于術(shù)前月經(jīng)干凈后2～3d的清晨，空腹抽取2組患者靜脈血（肘部）5ml，靜置于常溫下1h，在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液于凍存管，保存在-80℃冰箱中待檢，避免反復(fù)凍融。內(nèi)膜組織：實(shí)驗(yàn)組腹腔鏡術(shù)中取異位內(nèi)膜組織（內(nèi)膜異位囊腫壁組織），對(duì)照組子宮切除術(shù)后取子宮內(nèi)膜組織，置于有RNA保護(hù)液中保存在凍存管中，于-80℃冰箱中保存待檢，避免反復(fù)凍融。

4.2 檢測(cè)方法 采用ELISA方法檢測(cè)血清中VEGF的水平：采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）試劑盒（MM-0115H1，酶免），實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（WD-2102B，六一）進(jìn)行檢測(cè)，得到OD值和標(biāo)準(zhǔn)物的濃度，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式求出樣品濃度。采用Real-time PCR方法檢測(cè)內(nèi)膜組織中VEGF mRNA的表達(dá)：采用超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO，康為世紀(jì)）提取內(nèi)膜組織中的mRNA并用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度、純度，用5×HiScript II qRT SuperMix II進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用2×SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增，采用CFX Connect?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和熒光定量；并繪制擴(kuò)增曲線及熔解曲線，運(yùn)用2-△△CT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料以（±s）表示，2組計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布2組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布2組間比較采用秩和檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。

結(jié) 果

1 2組血清中VEFG及內(nèi)膜中VEGF mRNA的表達(dá)

2組患者術(shù)前血清中VEGF水平及內(nèi)膜組織中VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2組有差異，實(shí)驗(yàn)組患者血清中VEGF及異位內(nèi)膜組織中VEGF mRNA的水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 2組血清中VEFG及內(nèi)膜中VEGF mRNA的表達(dá)情況比較（±s）

表3 2組血清中VEFG及內(nèi)膜中VEGF mRNA的表達(dá)情況比較（±s）

組別 例數(shù) VEGF/pg·ml-1 VEGF mRNA實(shí)驗(yàn)組 60 94.74±19.976 3.08±1.554對(duì)照組 60 52.17±12.507 1.35±1.157 Z 9.127 6.477 P＜0.05 ＜0.05

2 EMT患者血清中VEGF及內(nèi)膜中VEGF mRNA與血瘀積分的關(guān)系

EMT患者血清中VEGF及異位內(nèi)膜組織中VEGF mRNA與血瘀積分經(jīng)直線相關(guān)分析，結(jié)果提示EMT患者血清中VEGF及異位內(nèi)膜組織中VEGF mRNA的表達(dá)與其血瘀積分均具有相關(guān)性，呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.543和r=0.556（P＜0.05）。見表4。

表4 EMT患者血清中VEGF及內(nèi)膜中VEGF mRNA與血瘀積分關(guān)系比較

討 論

對(duì)于EMT的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病因及發(fā)病機(jī)制的探究，主要包括子宮內(nèi)膜異位種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)等。經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)認(rèn)為在經(jīng)期時(shí)，經(jīng)血可帶著脫落子宮內(nèi)膜組織，由輸卵管逆流入腹腔并種植于盆腔腹膜組織及卵巢上，不斷發(fā)展形成盆腔異位病灶[1，11]。但是“經(jīng)血逆流”并不能完全闡明EMT的逆流后，子宮內(nèi)膜在腹腔內(nèi)的復(fù)雜的發(fā)病過程，郎景和[12]提出的發(fā)病三部曲AAA模式，補(bǔ)充并完善了經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)的分子生物學(xué)機(jī)制。血管生成是“3A”的發(fā)病模式中的重要環(huán)節(jié)。局部異位內(nèi)膜的宮腔黏膜以外部位的生長(zhǎng)取決于新生血管的形成，血管生成在EMT的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。VEGF[13，14]被認(rèn)為是目前具有最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)作用的一種血管生長(zhǎng)因子。目前對(duì)于EMT，還缺乏高敏感度的臨床檢測(cè)方法，尋找無(wú)創(chuàng)的生物學(xué)檢測(cè)方法，能為疾病的早期診斷和治療，以及疾病的預(yù)防和隨訪提供有效的簡(jiǎn)易的方法。

1 EMT患者血清中VEFG及內(nèi)膜中VEGF mRNA的表達(dá)

VEGF是具有最高特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂劑，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行增生，促進(jìn)局部新生毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的形成；能通過降解破壞細(xì)胞外基質(zhì)，改變血管的通透性，使血漿蛋白及生長(zhǎng)因子外滲，為局部新生組織提供營(yíng)養(yǎng)和基質(zhì)，促進(jìn)新生毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的塑造和成纖維細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成組織間質(zhì)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VEGF在2組患者的血清中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。同時(shí)，許曉月、崔軼凡等[16，17]研究表明，內(nèi)異癥患者血清中可以發(fā)現(xiàn)VEGF，其血清中VEGF呈高表達(dá)。與本研究結(jié)論相一致。VEGF在EMT患者血清中表達(dá)存在異常，不僅能證明VEGF在本病發(fā)病中可能存在促進(jìn)的作用，同時(shí)也為未來(lái)早期發(fā)現(xiàn)并診斷內(nèi)異癥的檢測(cè)指標(biāo)提供新的選擇。

VEGF主要在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞、腺體細(xì)胞以及間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞中表達(dá)[32]。VEGF在月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜的修復(fù)工作中也發(fā)揮著作用。內(nèi)膜細(xì)胞在卵巢的激素的促進(jìn)作用下能分泌VEGF，由于EMT的異位病灶和子宮在位的內(nèi)膜腺體和間質(zhì)具有組織同源性，所以異位內(nèi)膜在卵巢的激素影響下也可分泌VEGF，VEGF可降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基質(zhì)的屏障作用，改變局部的微環(huán)境，從而促進(jìn)異位病灶的進(jìn)一步發(fā)生和發(fā)展[18]。李燦宇等[19]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF在EMT的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的表達(dá)水平均高于在正常內(nèi)膜組織中的水平，且VEGF在在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本課題結(jié)果顯示，2組組織中VEGF mRNA的水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），異位內(nèi)膜中的VEGF mRNA水平高于對(duì)照組，于上述研究結(jié)果相符合。在異位內(nèi)膜中VEGF的高表達(dá)，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新血管的形成，使異位內(nèi)膜得以成功種植、發(fā)展，異位病灶進(jìn)一步浸潤(rùn)、蔓延，不斷擴(kuò)大對(duì)盆腔周圍組織的破壞，使盆腔周圍組織的粘連等病理變化呈持續(xù)性發(fā)展，可見異位病灶中VEGF的表達(dá)增高是異位病灶種植、蔓延的重要因素，在發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

2 EMT患者血清中VEGF及內(nèi)膜中VEGF mRNA與血瘀積分的關(guān)系

中醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為，本病的發(fā)病根本是“瘀血阻滯胞宮、沖任”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病與經(jīng)血逆流，內(nèi)膜細(xì)胞在宮腔外的種植、浸潤(rùn)及血管形成有關(guān)，這與中醫(yī)學(xué)的“離經(jīng)之血”久而致瘀的理論相符合。而治療上，研究證實(shí)，抗VEGF抗體的抗血管生成藥物治療能有效延緩疾病發(fā)展，而中醫(yī)學(xué)的活血化瘀治療能明顯減低患者的血管生成因子水平，并且改善EMT患者臨床癥狀體征、減低術(shù)后復(fù)發(fā)率及提高受孕率[20]，治療方案上的原則、思路及療效上基本一致。通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀的分子生物學(xué)機(jī)制與中醫(yī)學(xué)的宏觀的臨床癥狀體征相結(jié)合，能夠探究中醫(yī)臨床證候的現(xiàn)代學(xué)的內(nèi)在機(jī)理。本研究通過收集臨床癥狀體征計(jì)算血瘀證素積分，研究血瘀程度與VEGF的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：EMT患者血清中VEGF水平及內(nèi)膜中VEGF mRNA的表達(dá)量與血瘀積分的關(guān)系，經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，兩者均呈正相關(guān)（P＜0.05）。EMT患者血清及內(nèi)膜中的VEGF與血瘀積分均具有相關(guān)性。且其相關(guān)趨勢(shì)與前面論述的VEGF對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的作用相符合。為臨床EMT的中醫(yī)病機(jī)辨證診斷提供客觀的現(xiàn)代理論基礎(chǔ)及生物學(xué)機(jī)制支持，同時(shí)也為EMT的臨床中醫(yī)活血祛瘀等治療方案提供了新的現(xiàn)代學(xué)理論依據(jù)。

綜上所述，血管生長(zhǎng)在EMT的發(fā)病過程中起著不可替代的重要作用，VEGF在血管生成的整個(gè)過程中都參與了調(diào)控的作用；VEGF與EMT血瘀證的證候內(nèi)在本質(zhì)之間存在相關(guān)性，為臨床EMT的中醫(yī)診治提供和補(bǔ)充現(xiàn)代基礎(chǔ)理論的支持和依據(jù)。