徐彪 李玉發(fā) 牛海龍 李偉堂 劉紅欣 王偉 吳松權(quán) 何中國

摘要 [目的]提高花生育種效率。[方法]從10對AhMITE引物中篩選出對雜交親本具有差異條帶的標(biāo)記引物，分別對10個(gè)花生雜交組合197個(gè)F1 代單株進(jìn)行真?zhèn)坞s種鑒定。[結(jié)果]根據(jù)PCR擴(kuò)增的父母本帶型，共鑒定出75個(gè)真雜種單株，真雜種比例為38.02%。[結(jié)論]利用AhMITE分子標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地對花生雜交F1 代進(jìn)行真?zhèn)舞b定，為進(jìn)一步使用AhMITE分子標(biāo)記技術(shù)對吉林省花生新品種選育及花生種質(zhì)資源遺傳多樣性分析提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 花生;F1真?zhèn)舞b定;AhMITE標(biāo)記

中圖分類號 S565.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）11-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Identification of F1 Generation Peanut Hybrids Using AhMITE Molecular Markers

XU Biao1，2，LI Yu-fa2，NIU Hai-long2 et al

（1.Agricultural College of Yanbian University，Yanji，Jilin 133000;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling，Jilin 136110）

Abstract [Objective]In order to improve the efficiency of flower breeding.[Method]Screened from 10 pairs of AhMITE primers for the marker primers with different bands in the hybrid parents，197 F1 single plants of 10 peanut cross combinations were used to identify the true and false hybrids.[Result]According to the parental band type amplified by PCR，a total of 75 true hybrid single plants were identified，and the true hybrid ratio was 38.02%.[Conclusion]The AhMITE molecular marker can be used to quickly and accurately identify the authenticity of the peanut hybrid F1 generation.It is expected to provide technical support for the further use of the AhMITE molecular marker technology in the selection of new peanut varieties in Jilin Province and the analysis of the genetic diversity of peanut germplasm resources.

Key words Peanut;F1 authenticity test;AhMITE mark

栽培花生 ?（Arachis hypogaea ?Linn.） 是世界上種植最廣泛的食用豆類之一，因其高蛋白質(zhì)與不飽和油含量而受到重視[1]。雜交育種是花生新品種選育的主要途徑，然而在花生去雄過程中母本的8個(gè)雄蕊清除不徹底或不及時(shí)，經(jīng)常會導(dǎo)致F1出現(xiàn)假雜種[2]。傳統(tǒng)表型鑒定花生真?zhèn)坞s種的方法，對于父母本表型差異較小的雜種很難辨認(rèn)，而通過分子標(biāo)記技術(shù)鑒定花生F1代真?zhèn)坞s種極大地提高了鑒別準(zhǔn)確性。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子（miniature inverted repeat transposable element，MITE）是 由Bureau等[3]最先在玉米中發(fā)現(xiàn)并命名的，且大多數(shù)分布于真核組織中。MITE通常在植物基因組中擴(kuò)增，像DNA 轉(zhuǎn)座子一樣，擁有TIR和TSD，但不編碼轉(zhuǎn)座酶[4]。MITE標(biāo)記技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果用瓊脂糖凝膠即可鑒定，相比聚丙烯酰胺凝膠鑒定，操作簡單方便，在玉米、水稻等植物上得到有效應(yīng)用[5-6]。

有關(guān)AhMITE在花生上的應(yīng)用，Patel等[7]利用MITE標(biāo)記將2種含有插入的突變體與正常油酸花生品種和天然存在的高油酸突變體區(qū)分開。Gayathri等[8]從33個(gè)不同基因型的花生全基因組重測序數(shù)據(jù)（WGRS）中鑒定出465個(gè)已報(bào)道的標(biāo)記，共獲得2 957個(gè)新的AhMITE1標(biāo)記。Kolekar等[9]使用MITE標(biāo)記對銹病抗性進(jìn)行了驗(yàn)證。王輝等[10]通過AhMITE分子標(biāo)記技術(shù)對115份花生材料進(jìn)行DNA多態(tài)性及聚類分析。以上結(jié)果表明，MITE可以廣泛地應(yīng)用于花生育種，為花生新品種選育及優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。目前關(guān)于利用 AhMITE 轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記技術(shù)對花生進(jìn)行真?zhèn)舞b定的報(bào)道很少，王潔等[11]利用7對轉(zhuǎn)座子引物對166個(gè)F1單株進(jìn)行鑒定，真雜種比率為47.59%。尹亮等[12]建立了使用雜交種子子葉 DNA并結(jié)合AhMITE技術(shù)對F1代雜交種進(jìn)行真?zhèn)舞b定技術(shù)的研究。

筆者利用10對多態(tài)性AhMITE引物對10個(gè)花生雜交組合進(jìn)行F1代真?zhèn)坞s種鑒定，旨在為吉林省選育花生新品種和種質(zhì)創(chuàng)新提供技術(shù)支撐，同時(shí)為今后使用AhMITE分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 共選用 10個(gè)花生雜交組合，共14 份花生F1代親本材料（表1）。親本及 F1代均于2021年5月7日種植于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生育種研究團(tuán)隊(duì)雜交池。

1.2 基因組DNA提取及檢測

采用TIANGEN公司DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒的方法，提取花生基因組DNA，使用超微量分光光度計(jì)（Nano Drop 2000）和瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度，將總DNA稀釋為20 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AhMITE標(biāo)記引物篩選

從文獻(xiàn)[13]中選取10對 AhMITE引物（表2），由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。利用這10對AhMITE引物對親本進(jìn)行多態(tài)性分析，選出條帶清晰、穩(wěn)定、有明顯差異的標(biāo)記用于F1代雜種鑒定。

1.4 PCR擴(kuò)增程序及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系（10 μL）： Taq ?PCR Master Mix 5 μL，AhMITE正向引物（15 μmol/L）1 μL，AhMITE反向引物（15 μmol/L）1 μL，DNA 模板（20 ng/μL）1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，55～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。 PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，添加0.8 μL Gold View Ⅰ 型核酸染色劑在凝膠分子成像儀器上成像保存。

1.5 真?zhèn)坞s種鑒定

使用對父母本有多態(tài)性的AhMITE引物，對雜種F1代進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增帶型表現(xiàn)為雜合的為真雜種，帶型與母本相同為假雜種。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1 代群體 DNA 提取 該試驗(yàn)提取的花生組DNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測OD260/OD280在2.0左右。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，條帶清晰，質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

2.2 親本多態(tài)性AhMITE標(biāo)記引物的篩選 該試驗(yàn)選擇的 10對AhMITE引物在14個(gè)雜交親本中均可擴(kuò)增出條帶。其中，引物 AhTE0544使組合1、4、5、6、7、8、10的雙親條帶具有明顯差異，父母本帶型的分子量在100～500 bp（圖2、3）;AhTE0577 使組合2、3、9的雙親條帶具有明顯差異，父母本帶型的分子量在100～500 bp（圖4、5）。因此選用AhTE0544和AhTE0577 引物對14個(gè)雜交親本F1代進(jìn)行真?zhèn)舞b定。

2.3 F1后代真?zhèn)坞s種鑒定

篩選出對父母本有顯著差異的AhMITE標(biāo)記引物，分別對10個(gè)花生雜交組合進(jìn)行真?zhèn)坞s種鑒定。擴(kuò)增條帶僅表現(xiàn)為父本或者母本的為偽雜種，表現(xiàn)為雜合帶型的為真雜種。部分鑒定結(jié)果見圖3、5～6，10個(gè)雜交組合的真雜種比例見表1。其中，第5個(gè)組合真雜種率最高，達(dá)47.37%，第1個(gè)組合真雜率最低，僅25.00%，10個(gè)雜交組合平均真雜種比例為38.02%。

3 討論

花生雜交是選育優(yōu)異新品種和種質(zhì)創(chuàng)新最常用、最簡單的方法之一[14]。為了提高雜交群體的質(zhì)量，對雜種F1代進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要。由于花生染色體數(shù)目和基因型差異較大，導(dǎo)致花生不同品種間表型上差異也較大[15]。在分子標(biāo)記未被廣泛應(yīng)用之前，對于F1代真?zhèn)坞s種的鑒定基本采用形態(tài)標(biāo)記法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確性不高。分子標(biāo)記的鑒定不受外界環(huán)境的制約，直接反應(yīng)不同品種間差異，在作物早期即可鑒定[16]?；ㄉ鶩1雜種鑒定大多采用簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記，鑒定結(jié)果較好，但是制作聚丙酰胺凝膠及跑膠過程較為復(fù)雜。此外，利用SNP位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確性高，但是對于DNA濃度要求極高[17]。該試驗(yàn)利用AhMITE轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)對F1雜種進(jìn)行真?zhèn)舞b定，AhMITE重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，易操作，極大地提高了鑒定效率。

近年來，祁雪等[18]采用原位胚拯救技術(shù)并利用MITE轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記對F1代進(jìn)行鑒定，真雜種率為44.3%;和小燕等[19]采用SNP位點(diǎn)突變堿基G-T、籽仁表型性狀、SSR多態(tài)性標(biāo)記分析、四引物擴(kuò)增突變體系PCR和Sanger測序基因峰值圖分析4種方法對F1代進(jìn)行真?zhèn)坞s種鑒定;寧龍龍等[20]利用AhMITE轉(zhuǎn)座子標(biāo)記對F1后代群體78個(gè)單株進(jìn)行了鑒定，真雜種率為25.64%;仇靜靜等[21]利用MITE轉(zhuǎn)座子和SSR標(biāo)記對各雜交組合的F1代雜交種進(jìn)行真?zhèn)螜z測，254粒雜交F1中共鑒定出96粒真雜交種。

4 結(jié)論

該研究利用AhMITE分子標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地對花生雜交F1 代進(jìn)行真?zhèn)舞b定，可極大地提高花生育種效率，也可為進(jìn)一步使用AhMITE分子標(biāo)記技術(shù)對吉林省花生新品種選育及花生種質(zhì)資源遺傳多樣性分析奠定理論基礎(chǔ)。

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