亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        百蕊草LRR-RLKs基因的鑒定與生物信息學(xué)分析

        2022-06-16 09:51:22張文香常子麗李芳楊香香丁波曹劍鋒
        南方農(nóng)業(yè)·上旬 2022年5期
        關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)基因

        張文香 常子麗 李芳 楊香香 丁波 曹劍鋒

        摘 要 以百蕊草(Thesium chinense Turcz)為材料,根據(jù)硝酸銀誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),PCR克隆到兩條LRR-RLK基因,通過測序、生物信息學(xué)分析、熒光定量PCR等技術(shù)對兩條基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩條基因全長分別為1 278 bp與2 115 bp,分別編碼425和704個氨基酸,命名為TcLRR1和TcLRR2;TcLRR1與擬南芥EFR基因一致性最高,TcLRR2與水稻Xa21一致性最高;TcLRR2具有完整的LRR-RLK蛋白結(jié)構(gòu)(亮氨酸重復(fù)域、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、激酶域),而TcLRR1缺乏激酶域;TcLRR1與TcLRR2在非脅迫條件下的組織表達(dá)模式一致,都在葉片中表達(dá)最高。綜上所述,TcLRR2可作為百蕊草抗逆相關(guān)的LRR-RLK候選基因進(jìn)行后續(xù)的深入研究。

        關(guān)鍵詞 百蕊草;基因;LRR-RLK;TcLRR1;TcLRR2;生物信息學(xué)

        中圖分類號:Q343.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.09.001

        收稿日期:2022-01-22

        基金項目:貴州省科技廳自然科學(xué)研究基金項目(黔科合基礎(chǔ)〔2016〕1415,黔科合基礎(chǔ)〔2018〕1117);貴州省科技廳平臺人才項目(黔教合KY字〔2017〕5790-06);貴州林業(yè)科技項目(黔科合林〔2017〕01號);貴州省教育廳生物科學(xué)一流專業(yè)項目(〔2019〕46)。

        作者簡介:張文香(1984—),女,河北武邑人,博士,副教授,研究方向為植物栽培與植物生理。E-mail:zwx26_2006@126.com。

        *為通信作者,E-mail:caojianfeng@gznc.edu.cn。

        植物中的受體主要有雙元系統(tǒng)、受體激酶兩種,廣泛參與植物的生長、發(fā)育、脅迫、免疫等過程。受體激酶具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)三部分,根據(jù)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)的不同又可分為三種類型:含S結(jié)構(gòu)域的、富亮氨酸重復(fù)的、類表皮生長因子的[1]。其中,富亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶最多,此類受體的胞外區(qū)域一般具有多個富亮氨酸重復(fù)序列,具有與配體結(jié)合的功能。目前已在多種植物如擬南芥、玉米、水稻、橘類、大豆、薔薇科中鑒定出編碼此類受體的基因,最早是在玉米中鑒定出來的[2]。

        百蕊草(Thesium chinense Turcz)是檀香科(Santalaceae)多年生半寄生草本植物,具有清熱解毒、解暑的功效,在我國有著悠久的被用于疾病治療的歷史。百蕊草具有較強的抗菌消炎作用,通常用于治療炎癥相關(guān)疾病,是優(yōu)秀的廣譜抗菌中藥材,被譽為“天然抗生素”。對百蕊草粗提物和純化成分的藥理作用和臨床應(yīng)用研究證實,百蕊草具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種藥理作用[3-5]。百蕊草的植物化學(xué)成分研究表明,百蕊草中含有黃酮類、生物堿、多糖等成分,其中黃酮類是其重要的指標(biāo)性成分,在植物的生長、發(fā)育、繁殖和防御中起著多種生理作用。目前對于百蕊草的研究主要在栽培、代謝產(chǎn)物分離與提純等方面,在分子水平對其生長調(diào)控機理的研究還較少。本研究根據(jù)噴施硝酸銀(1 mmol·L-1)處理及對照轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù),篩選出了被硝酸銀誘導(dǎo)高調(diào)表達(dá)的富亮氨酸類受體蛋白激酶基因,對其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析,旨在為從分子水平研究百蕊草的次級代謝和抗逆性提供基礎(chǔ)。

        1? 材料與方法

        1.1? 實驗材料

        百蕊草樣品采自于貴陽市烏當(dāng)區(qū)東風(fēng)鎮(zhèn)試驗基地(106°81′ E, 26°64′ N),挑選野外自然生長處于初果期,長勢、大小和生理狀態(tài)基本一致的百蕊草植株作為實驗植株,采取根、莖、葉組織,迅速凍于液氮。

        1.2? 實驗方法

        1.2.1? 基因的鑒定和克隆

        根據(jù)本實驗室百蕊草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6]拼接序列獲得6 878 bp的序列,通過ORFFinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線分析工具,預(yù)測完整的開放閱讀框(Open Reading Frame),并進(jìn)行blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)在線搜索比對,初步確定基因類型。對通過在線預(yù)測得知的兩個較長的ORF (Open Reading Frame),分別為1 278 bp(ORF1)和2 115 bp(ORF2)進(jìn)行克隆,利用 Primer Premier 5 軟件設(shè)計特異引物,ORF1上游引物為 ORF1-F:5′-ATGAACAAACCCTACGTTATAG GTC-3′,下游引物為 ORF1-R:5′-TCAAATACCTGA CAGGTGGTTATCA-3′;ORF2上游引物為:5′-ATGCTCACCATGCTTGACATGCCTGC-3′,下游引物為:5′-CTACTCTCTTCCCGTGTCCTTGATAA-3′。

        引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 第 1 鏈為模板 進(jìn)行 PCR 擴增,50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系包含 25 μL Premix PrimeSTAR HS (TaKaRa) DNA 聚合酶,上、下游 引 物 ( 10 μmol·L-1) 各 2.5 μL,cDNA 模 板1 μL,ddH2O補齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序為: 98 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性 10 s,60 ℃退火 10 s,68 ℃延伸 60 s,30 個循環(huán);最后 68 ℃ 延伸 6 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離,切膠純化回收。回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體,采用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆并測序。

        1.2.2? RNA提取與cDNA合成

        采用生工生物的UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(B511321)提取百蕊草總RNA,采用Thermo Scientific的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EP0743)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

        1.2.3? 生物信息學(xué)分析

        在HMMER網(wǎng)站https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測;選擇http://web.expasy.org/網(wǎng)址中的ProtParam工具進(jìn)行理化性質(zhì)分析,包括分子量、等電點、親水性、穩(wěn)定性等。在http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html網(wǎng)站進(jìn)行信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測,在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網(wǎng)站進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測分析。

        1.2.4? 進(jìn)化樹分析

        以模式植物擬南芥LRR-RLK基因,以及TcLRR1和TcLRR2的蛋白質(zhì)全長序列構(gòu)建進(jìn)化樹,擬南芥LRR-RLK蛋白序列及構(gòu)建方法與參數(shù)選擇參考Wang等[7]。

        1.2.5? 熒光定量PCR

        以初果期百蕊草的根、莖、葉cDNA為模板,以18SRNA為內(nèi)參基因,選用ABI的熒光定量PCR試劑盒(B639273),在StepOne Plus型熒光定量PCR儀 (ABI, Foster, CA, USA)上進(jìn)行擴增。

        內(nèi)參基因引物序列為:

        18SRNA-F? 5′ TTCTTAGTTGGTGGAGCGATTT3′

        18SRNA-R? 5′ CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC3′

        目的基因引物序列為:

        TcLRR1-F? 5′CTTTCGGGTGTCATTCCTCC3′

        TcLRR1-R? 5′TCTGAAAAGGTCTCTTGGGATACT3′

        TcLRR2-F? 5′AATAACTCTTGCCACTGTAGGGT3′

        TcLRR2-R? 5′ATTTCATCCGTTGGCTTCC3′

        反應(yīng)體系為:上下游引物(10 μM)各0.4 μL,模板cDNA 2 μL,酶(SybrGreen qPCR Master Mix)10 μL,最后加ddH2O到20 μL。擴增45個循環(huán)。

        2? 結(jié)果與分析

        2.1? 基因鑒定與分析

        根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接得到6 878 bp的序列,通過在線預(yù)測得知有兩個較長的ORF (Open Reading Frame),設(shè)計PCR引物進(jìn)行克隆驗證,經(jīng)過測序,確定兩條序列分別為1 278 bp(ORF1)和2 115 bp(ORF2)(見圖1),分別編碼425和704個氨基酸(見圖2)。將翻譯得到的蛋白序列在線進(jìn)行blast比對,發(fā)現(xiàn)ORF1的蛋白序列與擬南芥富亮氨酸類受體蛋白激酶EFR(At5g20480)、GSO1(At4g20140)、At3g47570一致性較高(見圖3a);ORF2的蛋白序列與水稻的類受體蛋白激酶Xa21及擬南芥At3g47570、EFR(At5g20480)一致性較高(見圖3b)。通過HMMSCAN在線分析保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)ORF1蛋白序列分別在121aa-181aa、338aa-398aa位具有一個亮氨酸富集區(qū)域(Leucine-rich repeat),不具有激酶結(jié)構(gòu)域;而ORF2蛋白序列在248-308aa具有重復(fù)亮氨酸區(qū)域,在418-689aa具有激酶結(jié)構(gòu)域(protein kinase domain)(見圖4)。由于兩個蛋白序列都具有富亮氨酸重復(fù)序列,因此將編碼ORF1的基因命名為TcLRR1,編碼ORF2的基因命名為TcLRR2。

        2.2? TcLRR1/2蛋白的理化性質(zhì)分析

        TcLRR1的分子量為46 458.17,等電點為5.97,全長425個氨基酸,其中帶負(fù)電荷的氨基酸為26個,帶正電荷的氨基酸20個,脂肪系數(shù)110.75,平均親水系數(shù)0.101,不穩(wěn)定系數(shù)26.77,為穩(wěn)定蛋白;TcLRR2的分子量為77 780.84,等電點為6.48,全長704個氨基酸,其中帶負(fù)電荷的氨基酸68個,帶正電荷的氨基酸64個,脂肪系數(shù)103.44,平均親水系數(shù)0.064,不穩(wěn)定系數(shù)33.48,為穩(wěn)定蛋白。

        2.3? 結(jié)構(gòu)預(yù)測

        在線對兩條基因的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測,發(fā)現(xiàn)TcLRR1序列1~24位為信號肽序列,沒有跨膜結(jié)構(gòu),預(yù)測其序列為胞外序列;TcLRR2序列1~28位為信號肽,357-377aa為跨膜區(qū)域,378-704aa位于膜內(nèi),29-356aa位于膜外。

        2.4? 磷酸化位點預(yù)測

        在線進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測,發(fā)現(xiàn)TcLRR1共具有46個磷酸化位點,其中絲氨酸(S)位點最多,為31個;其次是蘇氨酸(T)位點,為10個;酪氨酸(T)位點5個(見圖5a)。TcLRR2共具有89個磷酸化位點,其中絲氨酸(S)位點最多,為62個;其次是蘇氨酸(T)位點,為17個;酪氨酸(T)位點10個(見圖5b)。

        2.5? 序列比對與進(jìn)化樹分析

        通過TcLRR1與TcLRR2序列比對發(fā)現(xiàn),二者一致性僅16.09%。將兩者與擬南芥LRR-LRKs構(gòu)建進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)TcLRR1屬于VI-1亞組,TcLRR2屬于XII-1亞組,TcLRR1與blast比對的At3g47570、At5g20480及At4g20140都未聚在同一亞組(見圖6);TcLRR2與At3g47570和At5g20480(EFR)聚為同一亞組,與blast結(jié)果一致。

        2.6? 基因表達(dá)模式分析

        在非脅迫條件下,以初果期的根、莖、葉為材料,選擇葉片作為對照研究了TcLRR1和TcLRR2基因的相對表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)TcLRR1和TcLRR2在葉片中的表達(dá)量最高,在莖和根中的表達(dá)量低且兩者差異不明顯(見圖7)。

        3? 結(jié)論與討論

        近年來,高通量轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要手段,廣泛應(yīng)用于藥用植物新基因的發(fā)現(xiàn)、代謝途徑的確定,以及基因家族鑒定、進(jìn)化分析等方面。百蕊草是優(yōu)良的抗炎抗菌藥材,其中百蕊草素等黃酮類成分為主要活性成分,前期本課題組通過體外使用非生物誘導(dǎo)因子硝酸銀對百蕊草植株進(jìn)行誘導(dǎo)后,采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序研究百蕊草黃酮等化合物的次生代謝途徑、關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控等,通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序在獲得大量次生代謝相關(guān)序列信息的同時也獲得了包括LRR家族在內(nèi)的一些基因家族序列信息[6]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù),調(diào)取差異表達(dá)的6 878 bp的序列進(jìn)行分析,獲得兩個具有較長開放閱讀框的序列,blast比對結(jié)果表明二者都屬于LRR-RLKs,分別命名為TcLRR1和TcLRR2。對結(jié)構(gòu)域與跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn),TcLRR1蛋白缺乏跨膜區(qū)與激酶區(qū),屬于不完全的LRR-RLKs蛋白,TcLRR2具有較長ORF,具有完整的LRR-RLKs基因的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對兩個基因的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)TcLRR1在C端具有很長的缺失,因此推測TcLRR1可能不具有受體激酶的功能,其在植物體內(nèi)存在的意義還需進(jìn)一步驗證。

        不同物種LRR基因的核酸序列差異較大,同源性較低,但是LRR基因編碼的氨基酸序列具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[8]。TcLRR2基因結(jié)構(gòu)較完整,blastp比對發(fā)現(xiàn)它與水稻Xa21的一致性最高,而水稻Xa21基因與水稻的免疫性有關(guān)[9],因此猜測TcLRR2可能與百蕊草的抗逆性有關(guān)。目前通過轉(zhuǎn)錄組測序并進(jìn)行PCR驗證,獲得了兩個LRR基因序列,說明百蕊草與其他植物一樣存在著LRR基因家族[10-11]。植物抗性基因作為防衛(wèi)系統(tǒng)的一員,在沒有外界脅迫影響時表達(dá)量很低,當(dāng)有激發(fā)子或誘導(dǎo)子誘導(dǎo)時,抗性基因能高表達(dá),植物能夠識別并激活抗病信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)??剐曰蛟诓煌M織的表達(dá)也有差異性[12],本研究通過熒光定量的方法對這兩個基因在根、莖及葉中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)TcLRR1與TcLRR2表達(dá)趨勢一致,都是在葉片中表達(dá)量最高,莖和根中的表達(dá)量低且差異不明顯,表明該家族基因在百蕊草中可能存在組織特異性表達(dá)的特點,推測葉在逆境信號感知中更為敏感和重要。同時,TcLRR1與TcLRR2兩者蛋白序列一致性僅為16.09%,對于功能域不完整的TcLRR1來說,其表達(dá)的機理與意義還有待進(jìn)一步驗證。

        參考文獻(xiàn):

        [1]? 王小菁.植物生理學(xué)(第8版)[M].北京:高等教育出版社, 2019.

        [2]? WALKER J C, ZHANG R. Relationship of a putative receptor protein kinase from maize to the S-locus glycoproteins of Brassica[J]. Nature, 1990, 345: 743–746.

        [3]? 武祖發(fā),梁蓋敏,劉守金,等.百蕊草的生藥研究與寄主調(diào)查[J].中草藥,1993,24(8):429-430.

        [4]? 劉永松,羅曼,潘玲,等.抗菌中草藥百蕊草的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展,2006,30(6):252-255.

        [5]? 鄒懿,洪敏,楊笑芳.百蕊草化學(xué)成分分離[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2016,22(7):74-77.

        [6]? 曹劍鋒,張引,陳培玉,等.百蕊草轉(zhuǎn)錄組測序及黃酮合成相關(guān)基因分析[J].分子植物育種,2020,19(15):4977-4986.

        [7]? WANG J L, HU T H, WANG W H, et al. Investigation of evolutionary and expressional relationships in the function of the leucine-rich repeat receptor-like protein kinase gene family (LRR-RLK) in the radish (Raphanus sativus L.)[J]. Scientific Reports, 2019, 9: 6937.

        [8]? 張保龍,楊郁文,倪萬潮,等.陸地棉CC-NBS-LRR基因的克隆及特征分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,22(4):351-355.

        [9]? CADDELL D F, PARK C, THOMAS N C, et al. Silencing of the Rice Gene Lrr1 Compromises Rice Xa21 Transcript Accumulation and Xa21-Mediated Immunity[J]. Rice, 2017, 10(1): 23.

        [10] LIU P L, DU L, HUANG Y, et al. Origin and diversification of leucine-rich repeat receptor-like protein kinase (LRR-RLK) genes in plants[J]. BMC Evolutionary Biology, 2017, 17:47.

        [11] SUN J M, LI L T, WANG P, et al. Genome-wide characterization, evolution, and expression analysis of the leucine-rich repeat receptor-like protein kinase (LRR-RLK) gene family in Rosaceae genomes[J]. BMC Genomics, 2017, 18:763.

        [12] THURAU T, KIFLE S, JUNG C, et al. The promoter of the nematode resistance gene Hs1pro-1 activates a nematode-responsive and feeding site-specific gene expression in sugar beet (Beta vulgaris L.) and Arabidopsis thaliana[J]. Plant Mol Biol, 2003,52(3): 643-660.

        (責(zé)任編輯:丁志祥)

        猜你喜歡
        生物信息學(xué)基因
        Frog whisperer
        紅的基因 綠的本色
        中華詩詞(2020年8期)2020-02-06 09:26:54
        修改基因吉兇未卜
        奧秘(2019年8期)2019-08-28 01:47:05
        創(chuàng)新基因讓招行贏在未來
        商周刊(2017年7期)2017-08-22 03:36:21
        淺談醫(yī)學(xué)院校生物信息學(xué)專業(yè)青年教師規(guī)范培訓(xùn)模式的建立
        “PBL+E—learning”教學(xué)模式探索
        移動教學(xué)在生物信息學(xué)課程改革中的應(yīng)用
        今傳媒(2016年11期)2016-12-19 11:35:50
        中醫(yī)大數(shù)據(jù)下生物信息學(xué)的發(fā)展及教育模式淺析
        數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在生物信息學(xué)中的應(yīng)用
        生物信息學(xué)課堂危機及對策研究
        科技視界(2016年23期)2016-11-04 10:07:53
        国产精品成人免费视频一区| 给我看免费播放的视频在线观看 | 极品少妇在线观看视频| 99国产超薄丝袜足j在线播放| 调教在线播放黄| 国产亚洲女人久久久久久| 亚洲性码不卡视频在线| 一区二区激情偷拍老牛视频av| 91精品人妻一区二区三区水蜜桃| 日产精品高潮一区二区三区5月| 男人国产av天堂www麻豆| 少妇精品无码一区二区三区 | 五月综合激情婷婷六月| 亚洲精品无码av人在线播放| 国产真实夫妇视频| 精品亚洲成a人7777在线观看| 国产一起色一起爱| 国产精品18久久久久久不卡中国| 久久久婷婷综合五月天| 国产精品国产三级国a| 开心久久综合婷婷九月| 四虎影视久久久免费观看| 欧美人与动牲交a精品| 日韩精品中文字幕无码一区| 日子2020一区二区免费视频| 中文字幕亚洲无线码a| 精品在线视频免费在线观看视频| 国偷自拍av一区二区三区| 精品一区二区三区免费视频| 无码精品a∨在线观看| 久草视频福利| 亚洲色四在线视频观看| 激情偷拍视频一区二区| 亚洲中文字幕久久在线| 精品久久久久成人码免费动漫| 国产精品 高清 尿 小便 嘘嘘| 任你躁欧美一级在线精品免费| 91久久精品一区二区喷水喷白浆| 少妇被黑人整得嗷嗷叫视频| 久久精品国产亚洲av无码娇色 | 国产在线精品亚洲视频在线|