張文香 常子麗 李芳 楊香香 丁波 曹劍鋒

摘 要 以百蕊草（Thesium chinense Turcz）為材料，根據(jù)硝酸銀誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，PCR克隆到兩條LRR-RLK基因，通過測序、生物信息學(xué)分析、熒光定量PCR等技術(shù)對兩條基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩條基因全長分別為1 278 bp與2 115 bp，分別編碼425和704個氨基酸，命名為TcLRR1和TcLRR2;TcLRR1與擬南芥EFR基因一致性最高，TcLRR2與水稻Xa21一致性最高;TcLRR2具有完整的LRR-RLK蛋白結(jié)構(gòu)（亮氨酸重復(fù)域、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、激酶域），而TcLRR1缺乏激酶域;TcLRR1與TcLRR2在非脅迫條件下的組織表達(dá)模式一致，都在葉片中表達(dá)最高。綜上所述，TcLRR2可作為百蕊草抗逆相關(guān)的LRR-RLK候選基因進(jìn)行后續(xù)的深入研究。

關(guān)鍵詞 百蕊草;基因;LRR-RLK;TcLRR1;TcLRR2;生物信息學(xué)

中圖分類號：Q343.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.09.001

收稿日期：2022-01-22

基金項目：貴州省科技廳自然科學(xué)研究基金項目（黔科合基礎(chǔ)〔2016〕1415，黔科合基礎(chǔ)〔2018〕1117）;貴州省科技廳平臺人才項目（黔教合KY字〔2017〕5790-06）;貴州林業(yè)科技項目（黔科合林〔2017〕01號）;貴州省教育廳生物科學(xué)一流專業(yè)項目（〔2019〕46）。

作者簡介：張文香（1984—），女，河北武邑人，博士，副教授，研究方向為植物栽培與植物生理。E-mail：zwx26_2006@126.com。

*為通信作者，E-mail：caojianfeng@gznc.edu.cn。

植物中的受體主要有雙元系統(tǒng)、受體激酶兩種，廣泛參與植物的生長、發(fā)育、脅迫、免疫等過程。受體激酶具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)三部分，根據(jù)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)的不同又可分為三種類型：含S結(jié)構(gòu)域的、富亮氨酸重復(fù)的、類表皮生長因子的[1]。其中，富亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶最多，此類受體的胞外區(qū)域一般具有多個富亮氨酸重復(fù)序列，具有與配體結(jié)合的功能。目前已在多種植物如擬南芥、玉米、水稻、橘類、大豆、薔薇科中鑒定出編碼此類受體的基因，最早是在玉米中鑒定出來的[2]。

百蕊草（Thesium chinense Turcz）是檀香科（Santalaceae）多年生半寄生草本植物，具有清熱解毒、解暑的功效，在我國有著悠久的被用于疾病治療的歷史。百蕊草具有較強的抗菌消炎作用，通常用于治療炎癥相關(guān)疾病，是優(yōu)秀的廣譜抗菌中藥材，被譽為“天然抗生素”。對百蕊草粗提物和純化成分的藥理作用和臨床應(yīng)用研究證實，百蕊草具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種藥理作用[3-5]。百蕊草的植物化學(xué)成分研究表明，百蕊草中含有黃酮類、生物堿、多糖等成分，其中黃酮類是其重要的指標(biāo)性成分，在植物的生長、發(fā)育、繁殖和防御中起著多種生理作用。目前對于百蕊草的研究主要在栽培、代謝產(chǎn)物分離與提純等方面，在分子水平對其生長調(diào)控機理的研究還較少。本研究根據(jù)噴施硝酸銀（1 mmol·L-1）處理及對照轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出了被硝酸銀誘導(dǎo)高調(diào)表達(dá)的富亮氨酸類受體蛋白激酶基因，對其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析，旨在為從分子水平研究百蕊草的次級代謝和抗逆性提供基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

百蕊草樣品采自于貴陽市烏當(dāng)區(qū)東風(fēng)鎮(zhèn)試驗基地（106°81′ E， 26°64′ N），挑選野外自然生長處于初果期，長勢、大小和生理狀態(tài)基本一致的百蕊草植株作為實驗植株，采取根、莖、葉組織，迅速凍于液氮。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 基因的鑒定和克隆

根據(jù)本實驗室百蕊草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6]拼接序列獲得6 878 bp的序列，通過ORFFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析工具，預(yù)測完整的開放閱讀框（Open Reading Frame），并進(jìn)行blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）在線搜索比對，初步確定基因類型。對通過在線預(yù)測得知的兩個較長的ORF （Open Reading Frame），分別為1 278 bp（ORF1）和2 115 bp（ORF2）進(jìn)行克隆，利用 Primer Premier 5 軟件設(shè)計特異引物，ORF1上游引物為 ORF1-F：5′-ATGAACAAACCCTACGTTATAG GTC-3′，下游引物為 ORF1-R：5′-TCAAATACCTGA CAGGTGGTTATCA-3′;ORF2上游引物為：5′-ATGCTCACCATGCTTGACATGCCTGC-3′，下游引物為：5′-CTACTCTCTTCCCGTGTCCTTGATAA-3′。

引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 第 1 鏈為模板 進(jìn)行 PCR 擴增，50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系包含 25 μL Premix PrimeSTAR HS （TaKaRa） DNA 聚合酶，上、下游 引 物 （ 10 μmol·L-1） 各 2.5 μL，cDNA 模 板1 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序為： 98 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性 10 s，60 ℃退火 10 s，68 ℃延伸 60 s，30 個循環(huán);最后 68 ℃ 延伸 6 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠純化回收。回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，采用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆并測序。

1.2.2? RNA提取與cDNA合成

采用生工生物的UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（B511321）提取百蕊草總RNA，采用Thermo Scientific的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EP0743）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3? 生物信息學(xué)分析

在HMMER網(wǎng)站https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測;選擇http：//web.expasy.org/網(wǎng)址中的ProtParam工具進(jìn)行理化性質(zhì)分析，包括分子量、等電點、親水性、穩(wěn)定性等。在http：//www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html網(wǎng)站進(jìn)行信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測，在http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網(wǎng)站進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測分析。

1.2.4? 進(jìn)化樹分析

以模式植物擬南芥LRR-RLK基因，以及TcLRR1和TcLRR2的蛋白質(zhì)全長序列構(gòu)建進(jìn)化樹，擬南芥LRR-RLK蛋白序列及構(gòu)建方法與參數(shù)選擇參考Wang等[7]。

1.2.5? 熒光定量PCR

以初果期百蕊草的根、莖、葉cDNA為模板，以18SRNA為內(nèi)參基因，選用ABI的熒光定量PCR試劑盒（B639273），在StepOne Plus型熒光定量PCR儀 （ABI， Foster， CA， USA）上進(jìn)行擴增。

內(nèi)參基因引物序列為：

18SRNA-F? 5′ TTCTTAGTTGGTGGAGCGATTT3′

18SRNA-R? 5′ CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC3′

目的基因引物序列為：

TcLRR1-F? 5′CTTTCGGGTGTCATTCCTCC3′

TcLRR1-R? 5′TCTGAAAAGGTCTCTTGGGATACT3′

TcLRR2-F? 5′AATAACTCTTGCCACTGTAGGGT3′

TcLRR2-R? 5′ATTTCATCCGTTGGCTTCC3′

反應(yīng)體系為：上下游引物（10 μM）各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，酶（SybrGreen qPCR Master Mix）10 μL，最后加ddH2O到20 μL。擴增45個循環(huán)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 基因鑒定與分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接得到6 878 bp的序列，通過在線預(yù)測得知有兩個較長的ORF （Open Reading Frame），設(shè)計PCR引物進(jìn)行克隆驗證，經(jīng)過測序，確定兩條序列分別為1 278 bp（ORF1）和2 115 bp（ORF2）（見圖1），分別編碼425和704個氨基酸（見圖2）。將翻譯得到的蛋白序列在線進(jìn)行blast比對，發(fā)現(xiàn)ORF1的蛋白序列與擬南芥富亮氨酸類受體蛋白激酶EFR（At5g20480）、GSO1（At4g20140）、At3g47570一致性較高（見圖3a）;ORF2的蛋白序列與水稻的類受體蛋白激酶Xa21及擬南芥At3g47570、EFR（At5g20480）一致性較高（見圖3b）。通過HMMSCAN在線分析保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)ORF1蛋白序列分別在121aa-181aa、338aa-398aa位具有一個亮氨酸富集區(qū)域（Leucine-rich repeat），不具有激酶結(jié)構(gòu)域;而ORF2蛋白序列在248-308aa具有重復(fù)亮氨酸區(qū)域，在418-689aa具有激酶結(jié)構(gòu)域（protein kinase domain）（見圖4）。由于兩個蛋白序列都具有富亮氨酸重復(fù)序列，因此將編碼ORF1的基因命名為TcLRR1，編碼ORF2的基因命名為TcLRR2。

2.2? TcLRR1/2蛋白的理化性質(zhì)分析

TcLRR1的分子量為46 458.17，等電點為5.97，全長425個氨基酸，其中帶負(fù)電荷的氨基酸為26個，帶正電荷的氨基酸20個，脂肪系數(shù)110.75，平均親水系數(shù)0.101，不穩(wěn)定系數(shù)26.77，為穩(wěn)定蛋白;TcLRR2的分子量為77 780.84，等電點為6.48，全長704個氨基酸，其中帶負(fù)電荷的氨基酸68個，帶正電荷的氨基酸64個，脂肪系數(shù)103.44，平均親水系數(shù)0.064，不穩(wěn)定系數(shù)33.48，為穩(wěn)定蛋白。

2.3? 結(jié)構(gòu)預(yù)測

在線對兩條基因的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TcLRR1序列1～24位為信號肽序列，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測其序列為胞外序列;TcLRR2序列1～28位為信號肽，357-377aa為跨膜區(qū)域，378-704aa位于膜內(nèi)，29-356aa位于膜外。

2.4? 磷酸化位點預(yù)測

在線進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TcLRR1共具有46個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）位點最多，為31個;其次是蘇氨酸（T）位點，為10個;酪氨酸（T）位點5個（見圖5a）。TcLRR2共具有89個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）位點最多，為62個;其次是蘇氨酸（T）位點，為17個;酪氨酸（T）位點10個（見圖5b）。

2.5? 序列比對與進(jìn)化樹分析

通過TcLRR1與TcLRR2序列比對發(fā)現(xiàn)，二者一致性僅16.09%。將兩者與擬南芥LRR-LRKs構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)TcLRR1屬于VI-1亞組，TcLRR2屬于XII-1亞組，TcLRR1與blast比對的At3g47570、At5g20480及At4g20140都未聚在同一亞組（見圖6）;TcLRR2與At3g47570和At5g20480（EFR）聚為同一亞組，與blast結(jié)果一致。

2.6? 基因表達(dá)模式分析

在非脅迫條件下，以初果期的根、莖、葉為材料，選擇葉片作為對照研究了TcLRR1和TcLRR2基因的相對表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)TcLRR1和TcLRR2在葉片中的表達(dá)量最高，在莖和根中的表達(dá)量低且兩者差異不明顯（見圖7）。

3? 結(jié)論與討論

近年來，高通量轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要手段，廣泛應(yīng)用于藥用植物新基因的發(fā)現(xiàn)、代謝途徑的確定，以及基因家族鑒定、進(jìn)化分析等方面。百蕊草是優(yōu)良的抗炎抗菌藥材，其中百蕊草素等黃酮類成分為主要活性成分，前期本課題組通過體外使用非生物誘導(dǎo)因子硝酸銀對百蕊草植株進(jìn)行誘導(dǎo)后，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序研究百蕊草黃酮等化合物的次生代謝途徑、關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控等，通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序在獲得大量次生代謝相關(guān)序列信息的同時也獲得了包括LRR家族在內(nèi)的一些基因家族序列信息[6]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，調(diào)取差異表達(dá)的6 878 bp的序列進(jìn)行分析，獲得兩個具有較長開放閱讀框的序列，blast比對結(jié)果表明二者都屬于LRR-RLKs，分別命名為TcLRR1和TcLRR2。對結(jié)構(gòu)域與跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，TcLRR1蛋白缺乏跨膜區(qū)與激酶區(qū)，屬于不完全的LRR-RLKs蛋白，TcLRR2具有較長ORF，具有完整的LRR-RLKs基因的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對兩個基因的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)TcLRR1在C端具有很長的缺失，因此推測TcLRR1可能不具有受體激酶的功能，其在植物體內(nèi)存在的意義還需進(jìn)一步驗證。

不同物種LRR基因的核酸序列差異較大，同源性較低，但是LRR基因編碼的氨基酸序列具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[8]。TcLRR2基因結(jié)構(gòu)較完整，blastp比對發(fā)現(xiàn)它與水稻Xa21的一致性最高，而水稻Xa21基因與水稻的免疫性有關(guān)[9]，因此猜測TcLRR2可能與百蕊草的抗逆性有關(guān)。目前通過轉(zhuǎn)錄組測序并進(jìn)行PCR驗證，獲得了兩個LRR基因序列，說明百蕊草與其他植物一樣存在著LRR基因家族[10-11]。植物抗性基因作為防衛(wèi)系統(tǒng)的一員，在沒有外界脅迫影響時表達(dá)量很低，當(dāng)有激發(fā)子或誘導(dǎo)子誘導(dǎo)時，抗性基因能高表達(dá)，植物能夠識別并激活抗病信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)?？剐曰蛟诓煌M織的表達(dá)也有差異性[12]，本研究通過熒光定量的方法對這兩個基因在根、莖及葉中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TcLRR1與TcLRR2表達(dá)趨勢一致，都是在葉片中表達(dá)量最高，莖和根中的表達(dá)量低且差異不明顯，表明該家族基因在百蕊草中可能存在組織特異性表達(dá)的特點，推測葉在逆境信號感知中更為敏感和重要。同時，TcLRR1與TcLRR2兩者蛋白序列一致性僅為16.09%，對于功能域不完整的TcLRR1來說，其表達(dá)的機理與意義還有待進(jìn)一步驗證。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）