韓銘海 王未鮮 于志海

摘要 畢赤酵母是目前工業(yè)上生產重組蛋白最常用的宿主之一，而蛋白高水平表達技術一直是該領域的研究熱點。目前，成熟的分子生物學技術手段使改造N-糖基化修飾位點成為一種操作性較強的提高目標蛋白表達水平的策略。綜述了畢赤酵母中蛋白N-糖鏈的結構、其介導的CNX循環(huán)和對蛋白折疊的作用以及通過N-糖基化修飾位點改造促進蛋白表達的應用研究。

關鍵詞 畢赤酵母;N-糖基化修飾;異源蛋白;蛋白折疊

中圖分類號 Q78? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）11-0014-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.005

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress on the Effect of N-glycosylation on Production of Heterologous Proteins in ?Pichia pastoris

HAN Ming-hai，WANG Wei-xian，YU Zhi-hai

（Guizhou Institute of Technology，Guiyang，Guizhou 550000）

Abstract ?Pichia pastoris ?is one of the most popular eukaryotic hosts for producing heterologous proteins.However，increased secretion of certain proteins valued for their applications is essential in this field.Due to promoted techniques in molecule biology，engineering N-glycosylation sites of target proteins was easily manipulated and an effective way to increase their productions.This paper reviewed the structure of N-glycan of glycoproteins in ?Pichia pastoris， the effect of its participation in CNX cycle on protein folding，and engineering N-glycosylation sites of the target proteins for stimulating their productions.

Key words ?Pichia pastoris; N-glycosylation;Heterologous protein;Protein folding

畢赤酵母（ Pichia pastoris，最新分類名為Komagataella pastoris或Komagataella phaffii） 是科學研究和工業(yè)化生產蛋白類產品最常用的表達宿主。這種蛋白表達宿主具有高密度細胞培養(yǎng)、高效而可控的啟動子、蛋白翻譯后修飾、異源蛋白高效分泌表達、胞外蛋白易于分離和純化以及公認的安全性等優(yōu)點[1]，是當今最受歡迎的蛋白表達體系之一[2]。

獲得高水平表達一直是商業(yè)化生產蛋白類產品的重要前提條件之一。當前，提高畢赤酵母蛋白表達水平的主要技術有：一是發(fā)酵條件優(yōu)化策略，包括培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化、誘導策略優(yōu)化和高密度培養(yǎng)等傳統(tǒng)手段[3];二是分子生物學技術，如優(yōu)化密碼子、選用強啟動子和高效的信號肽、增加基因拷貝數等[3-4];三是改造蛋白、折疊、修飾和分泌途徑，以提高細胞蛋白合成速度和產量[3-4]，如通過共表達分子伴侶和PDI[5-6]等來提高內質網對異源蛋白的加工和折疊。近期的研究表明，在宿主細胞內質網中的錯誤折疊或是折疊的低效性是抑制某些異源蛋白高效表達的重要原因之一[7-10]。

1 新生肽高效折疊是其高水平表達的關鍵

在真核細胞內質網（ER）中，種類和數量較多的分子伴侶和輔助因子參與了新生肽的折疊加工，而細胞嚴謹的質量控制（quality control）機制確保了多肽的正確折疊，該復雜機制的低效性常常成為宿主表達蛋白的限速步驟[7-10]。另外有研究表明，通過采用優(yōu)化啟動子或增加基因拷貝數等策略，可以促進畢赤酵母表達外源蛋白，但相當含量的蛋白仍然滯留在胞內而未被分泌表達。究其原因，可能是蛋白在內質網中不能快速折疊，致使大量未折疊多肽聚集，這是限制蛋白高效分泌表達的主要因素[7-10]。肽鏈在ER中合成只需數十秒至幾分鐘，而新生肽在ER中停留時間可長達數十分鐘，最終，只有正確折疊的多肽才能被細胞輸送至高爾基體，接受進一步的修飾加工，非正確折疊蛋白被ER識別并進入內質網關聯降解途徑（ERAD），被泛素綴合酶修飾，最終在細胞質中被蛋白酶體徹底消化[5，7，9]。因此，提高新生肽折疊效率對蛋白的高水平表達至關重要。有研究表明，N-糖基化修飾對新生肽折疊有重要作用[11-12]。

2 N-糖基化修飾對蛋白表達的作用

一般來說，N-糖基化修飾參與了蛋白質合成折疊和轉運，有助于酵母中蛋白質的高效表達和分泌[13-14]。其作用主要有以下幾個方面：第一，沒有N-糖鏈的協(xié)助將可能會嚴重影響新生肽折疊的效率，而內質網內多肽的低效折疊將會被嚴格的內質網質量控制體系所識別，從而可能進入ERAD途徑而被降解[15];第二，N-糖鏈上的甘露糖可以與ERGIC-53結合。ERGIC-53是一種甘露糖凝集素受體，在從內質網轉運糖蛋白到高爾基體的過程中發(fā)揮重要作用[16];第三，N-糖鏈可有效地屏蔽多肽表面的疏水性區(qū)域從而抑制蛋白的聚集[17]。

2.1 畢赤酵母中糖蛋白的N-糖鏈結構

自然界中，蛋白糖基化修飾主要有兩類：N-糖基化修飾和O-糖基化修飾[18]。在原核和真核生物中，O-糖基化是蛋白常見的翻譯后修飾方式，在酵母細胞中，O-糖基化主要形式是絲氨酸和蘇氨酸羥基被O-甘露糖基化修飾[18]。畢赤酵母中蛋白O-糖基化修飾廣泛存在，但沒有N-糖基化修飾普遍[19]。

N-糖基化修飾是指β-構型的N-乙酰葡糖胺異頭碳與天冬酰胺的γ-酰胺N原子共價鏈接而成的N-糖苷鍵修飾[20]。在自然界中，蛋白氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr（Asn為天冬酰胺、Xaa是除了Pro以外任意氨基酸、Ser為絲氨酸、Thr為蘇氨酸）中，高達70%～90%的天冬酰胺殘基是被糖基化修飾的[21]。

根據結構差異，N-糖鏈可分為3類：高甘露糖型、復雜型和雜合型[20-21]。畢赤酵母中N-糖鏈是高甘露糖型（high mannose）（圖1），85%的N-糖鏈的結構為GlcNAc2Man8-14（GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，Man表示甘露糖），而GlcNAc2Man2為畢赤酵母中糖蛋白N-糖鏈最典型的結構[21]。

2.2 N-糖鏈對蛋白折疊的作用 一般說來，N-糖基化修飾促進蛋白折疊有兩種機制[22-23]。

2.2.1

N-糖鏈起分子伴侶的作用。一般說來，在內質網中，疏水作用是引起蛋白折疊的驅動力，非折疊狀態(tài)的蛋白的表面比天然活性狀態(tài)的蛋白的表面具有更多的疏水區(qū)域，這使得非折疊狀態(tài)的蛋白在細胞中擁擠的環(huán)境中易于發(fā)生聚集。目前，研究者普遍認可的關于N-糖基化修飾促進蛋白折疊的一種機理是：由于N-糖鏈是親水基團，肽鏈的N-糖基化能夠避免修飾位點附近與其他蛋白發(fā)生的疏水作用，提高了蛋白折疊的可逆性，從而促進了蛋白的折疊[11]。

2.2.2 N-糖鏈介導新生肽參與鈣聯蛋白（CNX）循環(huán)。基于作用機制的差異性，ER中分子伴侶系統(tǒng)可以分為2類：①經典分子伴侶系統(tǒng)（classical chaperones），主要是熱休克蛋白類，存在于整個細胞內，直接作用于多肽鏈，例如Bip（酵母中為Kar2p）、PDI和PPI等[23-24];②CNX循環(huán)系統(tǒng)，包括了鈣聯蛋白（CNX）和鈣網蛋白（CRT，酵母沒有鈣網蛋白），屬于凝集素分子伴侶，特異性地存在于內質網中，招募ERp57、UGGT、CypB等蛋白與N-糖鏈結合發(fā)生作用，通過CNX循環(huán)，促進新生肽蛋白的折疊（圖2）。同時，這些蛋白也具有經典分子伴侶的某些功能[23-24]。

2.3 N-糖鏈在內質網中的加工及介導CNX循環(huán)

在內質網中，寡糖轉移酶（OST）轉移結構為Glc3Man9GlcNAc2的糖鏈到新生肽N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/Thr）的天冬酰胺殘基上，此糖鏈依次被α-葡糖苷酶I和α-葡糖苷酶II切除最末端的兩個葡萄糖，形成GlcMan9GlcNAc2結構（圖1）[21]，此結構的糖鏈被CNX（酵母中為Cne1p蛋白）和CRT（酵母細胞中不存在這種蛋白）識別并結合[23-24]。CNX與新生肽結合后，招募ERp57和CypB（Cyclophilin B）等蛋白協(xié)同作用促進多肽的折疊。ERp57屬于二硫鍵異構酶（PDI）家族，CypB屬于肽基脯氨酸異構酶（PPI）家族，分別催化二硫鍵改組和脯氨酸異構化過程，是多數蛋白折疊過程中的限速步驟。α-葡糖苷酶II切除糖鏈末端的第三個葡萄糖，該切除過程速度小于切除第二個葡萄糖的速度，得到Man9GlcNAc2結構的糖鏈，其與CNX結合較弱，導致新生肽與CNX脫離（圖2），得到游離新生肽。如果游離新生肽正確折疊，將會被轉運到高爾基體，接受下一步的修飾和加工，而未正確折疊的新生肽將會被糖基轉移酶（UGGT）識別，并且催化糖鏈重新添加葡萄糖，再次得到GlcMan9GlcNAc2結構，并再次結合CNX，即又獲得再次折疊的機會[23-24]。經過多次CNX循環(huán)而未獲得活性結構的多肽，其糖鏈結構中的甘露糖將被α-甘露糖苷酶水解（圖1），這將阻止UGGT與新生肽結合，導致新生肽被淘汰出該CNX循環(huán)（圖2），最終被細胞的ERAD通路降解[23-24]。

3 畢赤酵母中N-糖基化修飾對蛋白表達作用的研究

3.1 N-糖基化修飾促進異源蛋白表達

較多研究表明，N-糖基化修飾對蛋白表達是有促進作用的。Han等[25]報道，去除彈性蛋白酶Asn-43、Asn-212和Asn-280位點的N-糖基化修飾，分別降低了其在畢赤酵母GS115中分泌表達水平的23.9%、63.6%和63.7%。Yang等[26]也報道，去除脂酶Asn-60位點的N-糖基化修飾完全抑制了其在畢赤酵母GS115中的表達。另外有研究表明，雞蛋卵清蛋白Asn-292的N-糖基化修飾對其在畢赤酵母中的折疊和高水平表達至關重要，而Asn-311位點的N-糖基化修飾對其表達作用不明顯[27]。在角質酶和美洲駝VHH抗體片段引入N-糖基化修飾可促進其在畢赤酵母中的折疊和表達，而在蛋白的N端引入N-糖基化修飾比在C段的效果更好[28]。Wei等[29]通過研究也發(fā)現，Asn-224位點的N-糖基化修飾對于真菌β-葡糖苷酶在畢赤酵母中折疊和高水表達也是必須的。Wang等[30]報道了破傷風毒素片段C蛋白的表達水平與其N-糖基化修飾水平也呈負相關。

另外，某些蛋白前導肽上的N-糖基化修飾對前導肽的切除和成熟蛋白的分泌也有著重要的作用。Han等[31]報道，在彈性蛋白酶前導肽Asn-51和Asn-93位置引入N-糖基化位點分別提高了其在畢赤酵母中表達量的104%和57%。Liu等[32]也報道，除去脂肪酶前導肽上的N-糖基化修飾則抑制了其在畢赤酵母中的表達?？梢酝茰y，前導肽上的N-糖基化修飾可能對蛋白的成熟和折疊以及分泌表達起著非常重要的作用。

3.2 N-糖基化修飾抑制異源蛋白表達

研究表明，蛋白的N-糖基化修飾對其表達有著負面影響。例如，Hoshida等[33]報道去除α-淀粉酶所有的N-糖基化位點提高了其在釀酒酵母中表達量的3倍;在破傷風毒素片段C蛋白Asn-320引入N-糖基化位點也抑制了其在畢赤酵母中的表達[30]。Han等[34]研究發(fā)現，在彈性蛋白酶Asn-67位點引入N-糖基化位點則完全抑制了其在畢赤酵母中的表達。

3.3 N-糖基化修飾對異源蛋白表達影響不顯著

研究表明，一些蛋白的N-糖基化修飾與其分泌表達水平幾乎沒有關系。Ito等[27]報道了卵清蛋白Asn-311位點的N-糖基化修飾不影響其在釀酒酵母中的分泌表達;Wang等[35]研究發(fā)現，尿激酶的N-糖基化修飾對其在畢赤酵母中的表達沒有顯著影響。

3.4 提高N-糖基化位點的修飾效率促進異源蛋白表達

研究者通過定點突變的技術可以研究異源蛋白上N-糖基化修飾對其表達水平的影響，也可以去除或引入N-糖基化修飾位點以提高其表達水平。一旦確定有利的N-糖基化修飾位點，那么可以通過采用更高效的N-糖基化修飾序列Asn-Xaa-Thr替代Asn-Xaa-Ser以提高特定位點的N-糖基化修飾效率，以此來增強N-糖基化修飾促進蛋白的效應。Han等[36]通過這種策略提高了彈性蛋白酶的N-糖基化修飾水平，而且也提高了其在畢赤酵母中的表達水平。另外，在N-糖基化修飾序列上游特定位點引入芳香族氨基酸序列也可以有效地提高N-糖基化位點的修飾效率[37-38]，可以推測，通過這種提高N-糖基化修飾效率的策略也可有效地促進目標蛋白的表達水平。

4 展望

畢赤酵母是目前工業(yè)上生產異源蛋白最常用的宿主，提高異源蛋白在畢赤酵母中的表達水平的新技術、新策略一直是該領域的研究熱點。N-糖基化修飾是畢赤酵母細胞中最常見的翻譯后修飾，N-糖鏈作為蛋白折疊的凝集素分子伴侶，介導新生肽參與內質網蛋白折疊質量控制以及轉運，因此對蛋白表達水平有著重要的影響。通過成熟分子生物學技術，研究者可以便捷地在目標蛋白的氨基酸序列中添加或是去除N-糖基化修飾位點，以研究其對蛋白表達水平的影響。已經有多篇文獻報道了通過引入N-糖基化修飾位點提高目標蛋白表達水平的研究，因此，通過N-糖基化修飾位點的改造是一種有效地提高目標蛋白表達水平的策略。

另外，目前關于N-糖基化修飾作用于蛋白折疊表達的理論還不夠完善，存在一定的不足。例如，CNX循環(huán)作用于新生肽的折疊過程與其N-糖鏈的蛋白位點特異性沒有關聯性，而實際研究發(fā)現，某些蛋白的不同位點N-糖鏈對其表達的作用是截然不同的。這些問題還有待研究者做進一步的研究以繼續(xù)完善相關的理論，從而進一步優(yōu)化通過N-糖基化位點改造促進蛋白表達的策略。

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