邵偉，張萬群，胡萬群，李維維，楊凱平，朱平平

化學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué))，合肥 230026

現(xiàn)代儀器分析是以利用現(xiàn)代科學(xué)儀器對物質(zhì)進(jìn)行定性分析、定量分析和結(jié)構(gòu)分析為基礎(chǔ)的一門科學(xué)，其應(yīng)用范圍涉及化學(xué)、材料、物理、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域，可促進(jìn)科學(xué)研究、助力科技創(chuàng)新[1]。研究生儀器分析實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)應(yīng)體現(xiàn)其高階性、創(chuàng)新性及挑戰(zhàn)度，培養(yǎng)學(xué)生掌握現(xiàn)代儀器操作和分析的手段與方法，輔助學(xué)生有效開展科學(xué)研究，提高學(xué)生綜合分析解決問題的能力。

研究生綜合儀器分析實(shí)驗(yàn)課程是中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心于2020年正式開設(shè)的一門研究生選修課，課程內(nèi)容包括X射線衍射、核磁共振、掃描電鏡、質(zhì)譜等十余種大型儀器(表1)，選課對象為來自長春應(yīng)化所、稀土研究所、蘇州納米所、材料系、科技史與科技考古系、近代力學(xué)系等十余個(gè)單位和方向的研究生，大部分為一年級的新生。學(xué)生在儀器分析方面的基礎(chǔ)普遍薄弱，而且水平參差不齊，因此，針對選課學(xué)生的基礎(chǔ)以及培養(yǎng)目標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)使用了“目標(biāo)導(dǎo)向式”教學(xué)方法。要求學(xué)生圍繞某一個(gè)目標(biāo)或任務(wù)自主學(xué)習(xí)，不僅培養(yǎng)了學(xué)生儀器操作的技能，還幫助他們掌握科學(xué)的邏輯思維方式和研究方法，為以后的科研工作打好基礎(chǔ)。

表1 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生綜合儀器分析實(shí)驗(yàn)課程設(shè)置

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)

冰片又稱龍腦，最早記載于《名醫(yī)別錄》[2]，2020年版《中國藥典》記載[3]，冰片分為天然冰片、艾片、合成冰片。天然冰片取材于樟科植物龍腦香樹或稱龍腦樟樹的新鮮枝葉，經(jīng)人工提取、加工制成結(jié)晶，其主要成分是右旋龍腦[(+)-borneol]。艾片取材于菊科植物艾納香的新鮮葉，經(jīng)人工提取、加工制成結(jié)晶，其主要成分為左旋龍腦[(?)-borneol]。合成冰片又稱機(jī)制冰片，用樟腦及松節(jié)油經(jīng)人工化學(xué)方法加工而成，主要成分為右旋龍腦、左旋龍腦和異龍腦(圖1)，其人工合成的副產(chǎn)物異龍腦具有較大的毒性[4]。冰片常作為“藥引”，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冰片可以顯著有效地使血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)開放，使藥物能夠進(jìn)入到腦脊液當(dāng)中從而發(fā)揮出良好的治療作用[4-11]。例如冰片可以促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺藥物的吸收，對于帕金森病的治療很有幫助[12]。在相關(guān)研究工作中，對藥物中活性成分的定性和定量，是科研中的一項(xiàng)基本操作。

由于天然冰片較為難得，有很多企業(yè)使用合成冰片來代替天然冰片，合成冰片成分較為復(fù)雜，除了左旋龍腦和右旋龍腦，還含有異龍腦、樟腦等雜質(zhì)，其中有些成分不但對人身體無益，甚至可能是有害的，因此我們需要辨析和確定冰片中的活性成分右旋龍腦的含量。

圖1 龍腦的四種結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用氣相色譜、手性氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用三種分析方法來達(dá)到這一目的。涉及的知識點(diǎn)包括色譜分離、手性、手性分離，質(zhì)譜分析、譜圖解析，標(biāo)準(zhǔn)曲線法等等。

本實(shí)驗(yàn)采用“目標(biāo)導(dǎo)向”式教學(xué)模式。在學(xué)生進(jìn)實(shí)驗(yàn)室之前，布置本次實(shí)驗(yàn)要完成的任務(wù)，要求學(xué)生提前自學(xué)，實(shí)驗(yàn)操作前，對于要做什么有基本了解；在做實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)自己的不足，邊做邊學(xué)，及時(shí)反思總結(jié)，以適應(yīng)將來的科研工作。本實(shí)驗(yàn)的主要目標(biāo)是利用氣相色譜/氣質(zhì)聯(lián)用儀，建立定性定量方法，分析復(fù)雜混合物中的右旋龍腦成分，又可以分解為以下五個(gè)小任務(wù)(表2)，要求學(xué)生分工合作來完成此目標(biāo)。

表2 自選實(shí)驗(yàn)路線

1.2 實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生根據(jù)教師布置的課程任務(wù)，提前了解相關(guān)知識，如儀器原理、工作站操作等等。在實(shí)驗(yàn)過程中，需要四位同學(xué)分工合作，完成所有測試任務(wù)；實(shí)驗(yàn)完成后，學(xué)生要對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，進(jìn)而以科技論文的形式將實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果呈現(xiàn)出來；之后在小組討論、師生研討會等場合，以PPT答辯等方式進(jìn)一步交流，強(qiáng)化所學(xué)知識。

1.3 考核方式

本實(shí)驗(yàn)中使用個(gè)性化與層次化教學(xué)，對學(xué)生的儀器技能掌握程度不做統(tǒng)一要求。

實(shí)驗(yàn)一方面考查學(xué)生的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，比如實(shí)驗(yàn)操作是否規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄是否及時(shí)且完整、科技論文撰寫是否符合要求；另一方面考查學(xué)生的學(xué)習(xí)、思維及分析能力，比如課前是否及時(shí)預(yù)習(xí)并查閱資料、實(shí)驗(yàn)過程中的分析是否合理、是否能提出自己的創(chuàng)新思路或想法等等。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

本實(shí)驗(yàn)中涉及了氣相色譜、手性氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用儀的使用，所用儀器如表3所示。

表3 實(shí)驗(yàn)所用儀器及色譜柱

2.2 待測樣準(zhǔn)備

(1) 冰片樣品：稱取1 g左右冰片，用甲醇定容于100 mL容量瓶中作為儲備液。取100 μL儲備液，加入900 μL甲醇置于2 mL進(jìn)樣瓶中貼上標(biāo)簽備用。

(2) 艾片樣品：稱取1 g左右艾片，用甲醇定容于100 mL容量瓶中作為儲備液。取100 μL儲備液，加入900 μL甲醇置于2 mL進(jìn)樣瓶中貼上標(biāo)簽備用。

(3) 合成冰片樣品：稱取1 g左右合成冰片，用甲醇定容于100 mL容量瓶中作為儲備液。取100 μL儲備液，加入900 μL甲醇置于2 mL進(jìn)樣瓶中貼上標(biāo)簽備用。

(4) 異龍腦樣品：稱取1 g左右異龍腦，用甲醇定容于100 mL容量瓶中作為儲備液。取100 μL儲備液，加入900 μL甲醇置于2 mL進(jìn)樣瓶中貼上標(biāo)簽備用。

(5) 未知樣品：稱取1 g左右未知龍腦樣品，用甲醇定容于100 mL容量瓶中作為儲備液。取100 μL儲備液，加入900 μL甲醇置于2 mL進(jìn)樣瓶中貼上標(biāo)簽備用。

(6) 某品牌滴眼液樣品：取某品牌滴眼液15 mL，加入5 mL乙酸乙酯萃取，離心，取上層乙酸乙酯溶液作為供試品。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

任務(wù)1：設(shè)定氣相色譜儀器1參數(shù)，對1-4號樣品進(jìn)行檢測，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定各龍腦組分的保留時(shí)間。

任務(wù)2：設(shè)定氣相色譜儀器2參數(shù)，對1-3號樣品進(jìn)行檢測，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定左旋/右旋龍腦的保留時(shí)間。

任務(wù)3：設(shè)定氣質(zhì)聯(lián)用儀參數(shù)，對1-6號樣品進(jìn)行檢測，對質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，結(jié)合保留時(shí)間對每個(gè)樣品中各組分進(jìn)行定性，找出標(biāo)簽錯(cuò)誤的樣品。

任務(wù)4：結(jié)合氣相色譜與氣質(zhì)聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析5號樣品中具體有哪些組分。

任務(wù)5：設(shè)定氣相色譜儀器2參數(shù)，取1號樣儲備液進(jìn)行逐級稀釋，分別進(jìn)樣，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，估算某滴眼液中右旋龍腦的含量。

4 結(jié)果與討論

4.1 任務(wù)1

對實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，確定使用以下參數(shù)對樣品進(jìn)行分離，1-4號樣的色譜圖如圖2所示，對色譜圖進(jìn)行分析可知，本色譜柱對左旋龍腦和右旋龍腦沒有分離效果，都在同一個(gè)位置(保留時(shí)間6.221 min)出峰，合成龍腦除了龍腦的峰之外，還在5.969 min處有一個(gè)峰，異龍腦的保留時(shí)間為4.870 min。

圖2 1-4號樣品色譜圖(WAX柱)

4.2 任務(wù)2

對實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，使用手性柱對1-3號樣進(jìn)行分析，得出的色譜圖如圖3所示，在手性柱上左旋龍腦(保留時(shí)間9.961 min)和右旋龍腦(10.065 min)基本能夠達(dá)到基線分離。

圖 3 1-3號樣品色譜圖(手性柱)

4.3 任務(wù)3

對實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，使用氣質(zhì)聯(lián)用儀對1-6號樣品進(jìn)行分析，1-2號樣品在保留時(shí)間5.26 min處有色譜峰，經(jīng)過譜圖分析確定為龍腦的峰。3號樣在5.14 min與5.26 min處有峰，經(jīng)過譜圖解析確定為異龍腦和龍腦的峰(圖4)。4號樣在4.91處有峰，經(jīng)過譜圖解析，確定其結(jié)構(gòu)并非異龍腦，而是樟腦(圖5)，后與樟腦色譜圖進(jìn)行比對后證實(shí)了這一結(jié)論；實(shí)驗(yàn)證明，4號樣品的標(biāo)簽錯(cuò)誤。

圖4 3號樣品的色譜圖(非極性柱)

圖5 幾種龍腦組分的質(zhì)譜圖

4.4 任務(wù)4

對5號樣分別進(jìn)行氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用測試，氣相色譜圖如圖6所示，對氣相色譜圖進(jìn)行分析可知，樣品中主要成分為樟腦(保留時(shí)間8.8 min左右)，含量大約為90%。其次還含有少量異龍腦與龍腦，此外在保留時(shí)間8.212 min左右也有峰出現(xiàn)，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析其可能為樟腦的同分異構(gòu)體(圖7)。

圖6 5號樣品色譜圖(手性柱)

圖7 5號樣中的雜質(zhì)成分

4.5 任務(wù)5

使用氣相色譜儀2對6號樣品進(jìn)行測定，得出該樣品進(jìn)行檢測在保留時(shí)間10.061 min位置有峰，說明該樣品中的龍腦含有右旋龍腦。取1號樣儲備液50、100、200、300、400 μL，分別加入950、900、800、700、600 μL甲醇于2 mL進(jìn)樣瓶中，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣，獲得右旋龍腦峰的峰面積如表4所示，由濃度與峰面積數(shù)據(jù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出6號樣中右旋龍腦的濃度為1.6034 mg·mL?1，由于該樣品是5 mL乙酸乙酯于15 mL滴眼液樣品中萃取而來，因此估算原滴眼液樣品中添加天然冰片的濃度為0.5344 mg·mL?1。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

圖8 右旋龍腦溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.6 課后思考題

(1) 氣相色譜、手性氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？針對檢測目的，應(yīng)該采用哪種儀器來分析更加合適？

(2) 談?wù)勗诒緦?shí)驗(yàn)中，可以如何優(yōu)化參數(shù)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更理想。

(3) 談?wù)剬?shí)驗(yàn)中的誤差可能會來自哪里，以及如何減小誤差。

(4) 談?wù)勗诜治龉ぷ髦?，?yīng)該怎樣逐步建立定性/定量分析方法；以及有哪些要注意的事項(xiàng)。

(5) 談?wù)勀銓Ρ緦?shí)驗(yàn)的感受，你認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)還可怎樣優(yōu)化/拓展。

5 實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)

對于研究生來說，他們在將來的科研生涯中可能會碰到一些實(shí)際問題，看起來非常復(fù)雜、無從著手；但是仔細(xì)分析就會發(fā)現(xiàn)，可以把一個(gè)比較大的問題分解成幾個(gè)較為簡單的小問題，這樣就能比較輕松地解決。本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)目的除了普及色譜知識以外，主要在于培養(yǎng)學(xué)生解決問題的思路，提高學(xué)生的科研綜合水平，包括自學(xué)能力、查閱文獻(xiàn)的能力、綜合分析問題的能力、團(tuán)隊(duì)合作能力，以及探索能力。

在科研生活中，往往會碰到儀器條件不足的情況，這時(shí)候就要想辦法，盡可能利用手頭的儀器條件，達(dá)到自己的測試目的。本實(shí)驗(yàn)選用了三種儀器，三種色譜柱，這三種儀器各有利弊：氣相色譜能很好地對樟腦、異龍腦、龍腦進(jìn)行分離，但無法對左旋龍腦與右旋龍腦進(jìn)行分離；手性氣相色譜能將左旋龍腦與右旋龍腦分離開，但無法對未知組分進(jìn)行定性；氣質(zhì)聯(lián)用儀可以對未知組分進(jìn)行定性，但非極性色譜柱分離效果不如氣相色譜，靈敏度也不如氫火焰離子化檢測器(FID)。因此我們希望學(xué)生能夠掌握每臺儀器的應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，在測試時(shí)，根據(jù)自己的測試需求選擇合適的儀器，而不是求全責(zé)備，追求最貴最好的儀器。

6 教學(xué)組織方式和教學(xué)方法

6.1 實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)安排和運(yùn)行方式

本實(shí)驗(yàn)的學(xué)時(shí)根據(jù)實(shí)際情況可安排4-8學(xué)時(shí)。本校研究生綜合儀器分析實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為4學(xué)時(shí)，使用小組循環(huán)的方式，每小組4人，同時(shí)使用三臺儀器進(jìn)行測試。氣質(zhì)聯(lián)用儀使用自動進(jìn)樣操作，同時(shí)學(xué)生使用兩臺氣相色譜儀手動進(jìn)樣完成色譜部分分析，實(shí)驗(yàn)需要小組成員分工合作完成。

6.2 目標(biāo)導(dǎo)向的混合式教學(xué)法

由于實(shí)驗(yàn)課時(shí)較短而內(nèi)容較多，本實(shí)驗(yàn)使用目標(biāo)導(dǎo)向的混合式教學(xué)法。教師將儀器原理、工作站操作錄制成微課視頻，放到學(xué)校Blackboard網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺，供學(xué)生實(shí)驗(yàn)課前進(jìn)行線上預(yù)習(xí)。學(xué)生提前了解實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題，熟悉使用到的儀器設(shè)備原理、構(gòu)造和操作技巧。在實(shí)驗(yàn)過程中分工合作，高效完成所有測試工作，所有數(shù)據(jù)匯總在一起完成一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)(表5)。對于教師來說，實(shí)驗(yàn)課開始之前的各種預(yù)習(xí)資源的準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)課上的引導(dǎo)、課后的交流互動都是非常必要的。

表5 實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)及時(shí)間分配

7 實(shí)驗(yàn)安全須知

(1) 本實(shí)驗(yàn)使用了氫氣，要注意用氣安全，測試完畢后要立即關(guān)閉氫氣。

(2) 本實(shí)驗(yàn)所用氣相色譜儀進(jìn)樣口、柱溫箱都有很高的溫度，要防止?fàn)C傷。

(3) 本實(shí)驗(yàn)使用了微量進(jìn)樣針，使用時(shí)要注意防止刺傷。

(4) 樣品有一定揮發(fā)性，要戴手套操作，盡量在通風(fēng)櫥中操作。

(5) 測試完畢后要把所有物品收拾好，儀器調(diào)至待機(jī)狀態(tài)。

8 結(jié)語

研究生儀器分析實(shí)驗(yàn)可以作為本科生實(shí)驗(yàn)和研究生將來科研工作的一個(gè)橋梁，除了掌握各種儀器技能之外，還要讓學(xué)生快速進(jìn)入科研狀態(tài)，從原有的“手把手教”轉(zhuǎn)變?yōu)椤案矣谏鲜帧⒏矣讵?dú)立思考、敢于探索”的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)完成了一個(gè)目標(biāo)導(dǎo)向式教學(xué)設(shè)計(jì)，培養(yǎng)了學(xué)生的科研技能和綜合思維能力，為他們將來的科研工作打下了良好的基礎(chǔ)。