張智勇，王 龍，馮繪敏，胡云飛，李 正，李文龍,3

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2.省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 100191)

三七是五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖，是我國傳統(tǒng)中藥材，味甘、微苦、溫，歸肝、胃經(jīng)，具有散瘀消腫、消腫止痛之功效，常用于吐血、咯血、便血、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等病癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，三七具有抑制動脈血栓和血小板活化的作用，可通過抗炎和抗氧化途徑保護心血管系統(tǒng)，減少腦損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，從而治療缺氧缺血性腦病。三七中皂苷類成分是其發(fā)揮臨床藥效的基礎(chǔ)，也是質(zhì)量控制的指標(biāo)[5]。迄今為止，從三七原料藥材的不同部位共分離出70多種皂苷成分，主要為達瑪烷型的20(S)-原人參二醇(20(S)-protopanaxadiol)和20(S)-原人參三醇(20(S)-protopanaxatriol)[6]。幾種主要的皂苷類成分結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 三七中主要皂苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of main saponins from Panax notoginseng

目前，我國以三七為原料制成的注射劑品種較多，如血塞通注射液、血栓通注射液、血栓通粉針劑等，這些制劑均具有活血祛瘀、擴張血管、促進血液循環(huán)的功效，臨床上常用于心腦血管類疾病的治療[7]，但三七總皂苷的成分、含量以及不同皂苷所占的比例各不相同。其中，注射用血栓通(凍干)于1993年正式生產(chǎn),2002年收載入《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》經(jīng)絡(luò)肢體腦系分冊，是一種治療缺血性疾病的中藥處方[8-11]。趙一懿等[12]采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)法全面比較血塞通、血栓通注射液中化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對照提取物及血栓通注射液中極性小的成分較少，而血塞通注射液中極性小的成分較多，可能是由于選取三七的部位不同，或者各廠家提取總皂苷工藝不同所致。血塞通注射液制劑過程受原料藥材、三七總皂苷提取[13-15]、過濾[16-17]、純化工藝[18-19]等諸多因素影響。李釗文等[20]考察了三七總皂苷提取液的層析濃縮方法，提高了三七總皂苷的快速濃縮富集能力；耿魁魁等[21]采用正交試驗法優(yōu)選注射用血塞通調(diào)配工藝，并對人參皂苷R1在不同溶媒中的穩(wěn)定性進行考察；熊海偉等[22]通過觀察三七總皂苷超濾前后的瞬時濃度變化，研究不同孔徑的濾膜對三七總皂苷動態(tài)透過率的影響，發(fā)現(xiàn)超濾過程中，人參皂苷Rb1和Rd損失較大，而藥液溫度和濾膜孔徑對三七中活性成分的動態(tài)透過率有顯著影響；張琳等[23]通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選大孔樹脂分離純化三七總皂苷的工藝條件及參數(shù)，通過靜態(tài)吸附法優(yōu)選大孔樹脂型號，發(fā)現(xiàn)D101型大孔樹脂吸附效果最好。

HPLC法和HPLC-Q-TOF MS法可用于快速鑒定和分析含有三七皂苷和人參皂苷類成分的化合物。Wu等[24]采用UPLC-MS/MS法同時測定了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及其皂甙元；Liu等[25]采用UPLC-Q-TOF MS法測定三七中主要皂苷類成分，并對其指紋圖譜進行分析和鑒定，為三七總皂苷的真?zhèn)舞b別提供了一種快速的質(zhì)量評價方法；趙靜等[26]采用UPLC-Q-TOF MS法快速鑒定三七中17種化合物，包括4對人參皂苷同分異構(gòu)體，并探討其裂解規(guī)律及特征離子。

本實驗擬采用HPLC法對三七原料藥材提取液和注射用血栓通(凍干)進行定性分析，根據(jù)出峰時間鑒定主要色譜峰，采用HPLC-Q-TOF MS法對比分析三七原料藥材提取液和注射用血栓通(凍干)中活性成分，闡明三七原料藥材到注射用血栓通(凍干)過程皂苷類成分的轉(zhuǎn)移規(guī)律，旨為進一步的工藝優(yōu)化及工藝評價提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity高效液相色譜分析系統(tǒng)：美國Waters公司產(chǎn)品；5600 Q-TOF MS高分辨質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)，SCIEX OX數(shù)據(jù)軟件處理系統(tǒng)。

三七原料藥材及血栓通注射液：由廣西梧州制藥(集團)股份有限公司提供，二者為對應(yīng)關(guān)系；三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rd、Re、F2以及七葉膽苷ⅩⅦ：純度≥95%，上海源葉生物公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)、甲酸(質(zhì)譜純)：美國Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 三七提取物的制備

稱取一定量的三七原料藥材，用10倍70%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓真空濃縮，干燥，密封保存，備用。

1.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取2 mg三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rd、Re、F2，七葉膽苷ⅩⅦ對照品粉末于10 mL容量瓶中，甲醇溶解至刻度，搖勻，稀釋100倍，過0.45 μm微孔濾膜，即得對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

精密稱取0.50 g三七提取物凍干粉，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲20 min，放冷，甲醇定容，搖勻，稀釋100倍，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

精密稱取適量的注射用血栓通(凍干)，用甲醇稀釋成約含5 mg/L總皂苷的溶液，即得供試品溶液。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱溫40 ℃；流動相為0.01%甲酸-水(A)-0.01%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～6 min(82%A)，6～12 min(82%～79%A)，12～14 min(79%～70%A)，14～21 min(70%～55%A)，21～35 min(55%～25%A)，35～40 min(25%～20%A)，40～45 min(20%～10%A)；流速0.35 mL/min；進樣量5 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 ESI離子源，負離子模式采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓4.5 kV，離子源溫度500 ℃，碰撞能量35 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七皂苷成分HPLC特征圖譜

8個參考化合物的混合溶液、三七原料藥材提取液以及注射用血栓通(凍干)的HPLC特征圖譜示于圖2?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液中，8種常見的參考化合物在高效液相色譜中實現(xiàn)基線分離；相較于三七原料藥材提取液，注射用血栓通(凍干)的色譜圖中化學(xué)成分較少，保留時間25 min后，三七原料藥材提取液的譜圖仍顯示有少量的色譜峰信號，但注射用血栓通(凍干)中幾乎沒有出現(xiàn)色譜峰信號?？傊琀PLC法對三七原料藥材中皂苷類成分的分析具有快速、分離效能高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于三七原料藥材提取物及其制劑的研究。然而，三七原料藥材中皂苷類成分種類繁多，例如，譜圖中人參皂苷Rb1附近的色譜峰十分豐富；此外，由于三七原料藥材中七葉膽苷ⅩⅦ、人參皂苷Rg3、三七皂苷R2和人參皂苷F3等化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式相似，在HPLC色譜圖中峰面積很小，難以鑒別。故通過對質(zhì)譜碎片離子進行解析，進一步鑒別三七中主要皂苷類成分。

注：a.混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；b.三七原料藥材提取液；c.注射用血栓通(凍干)圖2 三七皂苷類成分的特征HPLC色譜圖Fig.2 Characteristic chromatograms of saponins in Panax notoginseng by HPLC

2.2 負離子模式下的總離子流圖

8種三七皂苷類成分混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流圖示于圖3a。在ESI-模式下，8種對照品得到了完全分離。三七原料藥材提取液與注射用血栓通(凍干)的總離子流圖分別示于圖3b、3c。可以觀察到，峰信號主要集中在25 min前，表明三七原料藥材提取物和注射用血栓通(凍干)中主要為強極性和中等極性物質(zhì)，弱極性物質(zhì)較少。

2.3 各化合物的一、二級質(zhì)譜圖

在1.5節(jié)條件下，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的一、二級質(zhì)譜信息，分子質(zhì)量信息與理論值吻合，各化合物的母離子及碎片數(shù)據(jù)列于表1。結(jié)果表明，三七皂苷類成分僅發(fā)生皂苷上糖鍵的斷裂，并沒有苷元的進一步裂解，這是因為苷元的四元環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以破壞。各化合物的一級質(zhì)譜均出現(xiàn)[M+HCOO]-和[M-H]-離子。例如，三七皂苷R1的一級質(zhì)譜碎片信息為[M+HCOO]-m/z997和[M-H]-m/z931，在二級質(zhì)譜圖中觀察到m/z769[M-H-Glc]-、m/z637[M-H-C5H10O5-Glc]-以及m/z475[M-H-C5H10O5-Glc-Glc]-等碎片離子，示于圖4；人參皂苷Rb1的相對分子質(zhì)量為1 108，一級質(zhì)譜碎片信息中可觀察到m/z1 107[M-H]-、m/z1 153[M+HCOO]-等碎片離子峰，在二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)，該分子離子峰相繼失去4個葡萄糖分子后，分別得到m/z945、783、621、459的碎片離子峰，其碎片離子信息示于圖5。人參皂苷Rg1，Re，Rg2，Rd，F(xiàn)2以及七葉膽苷ⅩⅦ的質(zhì)譜圖示于圖6。

注：a.對照品；b.三七原料藥材提取液；c.注射用血栓通(凍干)圖3 三七皂苷類成分的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms of saponins in Panax notoginseng

表1 各化合物的母離子及主要碎片離子Table 1 Parent ions and major fragment ions of components

圖4 負離子模式下，三七皂苷R1的一級(a)、二級(b)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑(c)Fig.4 MS (a),MS/MS (b) spectra and proposed fragmentation pathways (c)of notoginsenoside R1 in negative ion mode

圖5 負離子模式下，人參皂苷Rb1的一級(a)、二級(b)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑(c)Fig.5 MS (a),MS/MS (b) spectra and proposed fragmentation pathways (c) of ginsenosides Rb1 in negative ion mode

圖6 負離子模式下，人參皂苷Re(a)、Rg2(b)、Rb1(c)、Rd(d)、F2(e)以及七葉膽苷ⅩⅦ(f)的一級質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectra of ginsenosides Re (a),ginsenosides Rg2 (b),ginsenosides Rb1 (c),ginsenosides Rd (d),ginsenosides F2 (e) and gypenoside ⅩⅦ (f) in negative ion mode

2.4 注射用血栓通(凍干)中皂苷類成分研究

通過觀察負離子模式下注射用血栓通(凍干)與三七原料藥材提取液的一、二級質(zhì)譜圖可知，一級電離出現(xiàn)[M+HCOO]-和[M-H]-等主要質(zhì)譜信號峰，而二級電離出現(xiàn)糖基的斷裂，可觀察到皂苷苷元的碎片峰信號。通過與8種對照品溶液以及三七原料藥材提取液的總離子流圖進行對比，可以發(fā)現(xiàn)，幾種主要皂苷類成分在注射用血栓通(凍干)中均可檢測到。此外，由于三七中皂苷類成分存在較多同分異構(gòu)體，其相對分子質(zhì)量相同，結(jié)構(gòu)相似，如人參皂苷Rg2與人參皂苷F2的相對分子質(zhì)量均為783 u，人參皂苷Re、Rd以及七葉膽苷ⅩⅦ的相對分子質(zhì)量均為945 u，這些化合物僅通過質(zhì)譜信息難以鑒別，需要用對照品保留時間對比鑒別。

在三七原料藥材提取液以及注射用血栓通(凍干)的一、二級質(zhì)譜中，發(fā)現(xiàn)2個m/z783的分子離子峰。通過對比對照品的保留時間，確定出峰時間15.81 min為人參皂苷Rg2，推測另一個為人參皂苷Rg3。此外，分別在出峰時間15.37、13.69 min觀察到m/z769的分子離子峰，推測為三七皂苷R2和人參皂苷F3，但出峰順序存疑。

通過對比三七原料藥材提取物與注射用血栓通(凍干)中總皂苷成分的峰面積，發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb1、Rd、F2以及七葉膽苷ⅩⅦ的峰面積比值分別為2.55、6.88、3.02、9.75、31.30、15.68、15.98、714.34。其中，七葉膽苷ⅩⅦ的轉(zhuǎn)移率最低，僅為0.14%，而三七皂苷R1的轉(zhuǎn)移率最高，為39.22%。根據(jù)相關(guān)研究和實際生產(chǎn)經(jīng)驗，推測與制劑過程中大孔樹脂的填料有關(guān)，在后續(xù)的工藝優(yōu)化過程中，需要重視注射用血栓通(凍干)柱層析純化過程中所用大孔樹脂填料的比較和優(yōu)選。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC以及HPLC-Q-TOF MS法對三七原料藥材提取液和注射用血栓通(凍干)中化學(xué)成分進行表征，初步探討了由三七原料藥材到血栓通制劑過程中總皂苷的轉(zhuǎn)移規(guī)律，有助于增強對注射用血栓通(凍干)生產(chǎn)過程的理解，后續(xù)準(zhǔn)備對三七總皂苷的提取工藝和不同填料的大孔樹脂進行考察，優(yōu)化血栓通注射劑生產(chǎn)過程中的各項工藝參數(shù)，為提升生產(chǎn)過程的可控性提供參考。