韓印森，呂 博，許慶軒,2,3，劉淑瑩，周 芹,2,3

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，黑龍江 哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；5.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021)

對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析通常需要先進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，再進(jìn)行色譜分離，最后用質(zhì)譜檢測(cè)，1個(gè)樣品的前處理過(guò)程和色譜分離需要數(shù)小時(shí)的時(shí)間，而質(zhì)譜檢測(cè)僅需要幾秒鐘。前處理過(guò)程和色譜分離是導(dǎo)致檢測(cè)效率低的原因。

基于電噴霧離子源的原位分析技術(shù)有探針噴霧(probe electrospray ionization,PESI)[1]、木尖噴霧(wooden tips spray)[2]、葉噴霧(leaf spray)[3]、組織噴霧(tissue spray)[4]、直接電離(direct ionization)[5]等。探針噴霧和木尖噴霧的技術(shù)相似，都是將探針作為噴霧裝置，樣品附在針尖上加電壓產(chǎn)生噴霧，區(qū)別是使用的材料不同，分別采用金屬和木質(zhì)材料作為探針。葉噴霧、組織噴霧和直接電離技術(shù)是將樣品制作成尖端，加溶劑產(chǎn)生噴霧，樣品作為噴霧基體，不再使用額外的裝置。以上技術(shù)將質(zhì)譜由封閉式檢測(cè)轉(zhuǎn)為開(kāi)放式檢測(cè)，在常壓下即可運(yùn)行，不需要樣品前處理和色譜分離，可直接分析實(shí)際樣品[6-8]，是目前最受歡迎的質(zhì)譜技術(shù)之一?；诔ㄩ_(kāi)式電離質(zhì)譜，本課題組[9]開(kāi)發(fā)了以瓜子殼作為電噴霧木質(zhì)材料的新型電離源，具有如下優(yōu)點(diǎn)：將提取與檢測(cè)在線結(jié)合，縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率；樣品承載量大，能夠?qū)悠穬?nèi)部的成分提取出來(lái)，檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)，信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；樣品的適用范圍廣，可分析奶粉、土壤等粉末狀樣品。

本研究擬采用在線提取瓜子殼電噴霧技術(shù)，以瓜子殼作為提取和噴霧裝置，通過(guò)分析幾種復(fù)雜的基質(zhì)樣品，并與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，評(píng)估其在復(fù)雜基質(zhì)樣品分析中的性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

離子源：實(shí)驗(yàn)室自制，其原理、裝置示于圖1[9]。

圖1 在線提取電噴霧裝置圖Fig.1 Online-extraction of sunflower seed husk electrospray ionization mass spectrometry

將銅片固定在質(zhì)譜儀入口附近，將處理好的瓜子殼削尖置于銅片上，通過(guò)電夾將高壓施加在銅片上，控制瓜子殼尖端與質(zhì)譜儀入口的距離為3 mm左右。

LCQ Fleet 離子阱質(zhì)譜儀(配有Xcaliber工作站)、移液器：美國(guó)賽默飛世爾公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水機(jī)：美國(guó) Millipore公司產(chǎn)品；電子天平：日本島津公司產(chǎn)品；KQ-250DB 型超聲清洗器：昆山市超聲儀器公司產(chǎn)品；流動(dòng)注射泵：美國(guó)KD Scientific公司產(chǎn)品；銅片、可調(diào)節(jié)高壓直流電夾、生瓜子：均購(gòu)自本地市場(chǎng)。

1.2 主要材料與試劑

甲醇：天津富宇精細(xì)化工公司產(chǎn)品；莠去津標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)：德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；奶粉：大慶乳品廠產(chǎn)品；三聚氰胺(分析純)：天津科密歐化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；發(fā)芽的馬鈴薯：購(gòu)自本地市場(chǎng)；土壤：取自本地。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品處理 將莠去津標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)一步稀釋至0.01 mg/L，備用。取1 g土壤，倒入10 mL莠去津標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌均勻，配制成含0.01 mg/kg莠去津的土壤樣品；另取10 mL甲醇倒入土壤中作為空白對(duì)照，晾干至粉末狀。

用甲醇稀釋三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)一步稀釋至0.001 mg/L，備用。取1 g奶粉，倒入10 mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含0.01 mg/kg三聚氰胺的奶粉樣品；另取10 mL甲醇倒入奶粉中作為空白對(duì)照，晾干至粉末狀。

在發(fā)芽的馬鈴薯上取0.01 g馬鈴薯芽，以馬鈴薯芽為中心，分別在距其0.5、1、1.5 cm處刮取0.01 g馬鈴薯皮和馬鈴薯塊莖，用手術(shù)刀將其壓碎，備用。

1.3.2質(zhì)譜條件 正離子模式；全掃描方式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；瓜子殼尖端角度控制在60°～90°范圍內(nèi)，瓜子殼尖端與質(zhì)譜儀入口之間的距離為2～3 mm；噴霧電壓設(shè)置在3.5～4.5 kV范圍內(nèi)；離子傳輸毛細(xì)管溫度根據(jù)樣品而定；關(guān)閉所有去溶劑化氣體。

2 結(jié)果與討論

2.1 奶粉中三聚氰胺分析

2008年，“三鹿三聚氰胺事件”引起了人們對(duì)嬰幼兒奶粉安全性的廣泛關(guān)注，采用的檢測(cè)方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[10-11]，這些方法都需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。奶粉易溶于水、難溶于甲醇，而三聚氰胺易溶于甲醇、難溶于水，奶粉遇水后形成蛋白質(zhì)溶液，被高壓電離后會(huì)造成離子傳輸管堵塞。因此，向奶粉中加入甲醇將三聚氰胺提取出來(lái)，可避免形成蛋白質(zhì)溶液。三聚氰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖2。

圖2 三聚氰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure of melamine

本實(shí)驗(yàn)分別稱取0.01 g空白樣品和含0.01 mg/kg三聚氰胺的樣品，依次放入瓜子殼中，向每份樣品注射0.2 mL甲醇提取三聚氰胺，得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖。三聚氰胺呈堿性，在正離子模式下容易質(zhì)子化形成[M+H]+分子離子，獲得m/z127信號(hào)峰。空白奶粉質(zhì)譜圖示于圖3a，未觀察到m/z127信號(hào)峰，表明奶粉中的成分對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)沒(méi)有影響；含0.01 mg/kg三聚氰胺奶粉的質(zhì)譜圖示于圖3b，可觀察到明顯的m/z127信號(hào)峰，背景峰沒(méi)有干擾。根據(jù)《食品安全法》及其實(shí)施條例規(guī)定：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg。本方法的檢測(cè)限低于0.01 mg/kg，能夠滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。與傳統(tǒng)方法相比，該方法對(duì)每個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)1 min，可用于奶粉中三聚氰胺的快速檢測(cè)。

圖3 空白奶粉(a)和含0.01 mg/kg三聚氰胺奶粉(b)的在線提取瓜子殼電噴霧質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of blank milk powder (a) and milk powder spiked with 0.01 mg/kg melamine (b) using OE-SSH-ESI-MS

2.2 土壤中莠去津分析

土壤基質(zhì)十分復(fù)雜，在溶液中形成膠體，對(duì)除草劑成分有強(qiáng)烈的吸附作用，前處理十分困難[12]，并且土壤樣品數(shù)量龐大，使用傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難滿足檢測(cè)需要，尋找快速檢測(cè)方法是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵。

莠去津，又稱阿特拉津，是一種三嗪類除草劑，其結(jié)構(gòu)式示于圖4。本實(shí)驗(yàn)分別稱取0.01 g空白樣品和含0.1、0.01 mg/kg的莠去津樣品，依次放入瓜子殼中，向每份樣品注射0.2 mL甲醇提取莠去津，得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖。在空白土壤中，未觀察到m/z216離子，說(shuō)明土壤中雜質(zhì)成分對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)沒(méi)有影響，示于圖5a；含0.1 mg/kg莠去津土壤樣品的質(zhì)譜圖示于圖5b，可觀察到明顯的莠去津質(zhì)譜峰m/z216；即使莠去津含量低至0.01 mg/kg，本方法也能檢測(cè)出來(lái)，示于圖5c，其余峰均為背景峰。

圖4 莠去津化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structure of atrazine

圖5 空白土壤(a)、含0.1 mg/kg(b)、0.01 mg/kg(c)莠去津土壤的在線提取瓜子殼電噴霧質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of blank soil (a) and soil spiked with 0.1 mg/kg (b),0.01 mg/kg (c) atrazine using OE-SSH-ESI-MS

本方法無(wú)需前處理，1 min內(nèi)即可得出結(jié)果，不僅操作簡(jiǎn)便，即使目標(biāo)化合物含量低至0.01 mg/kg也能被檢測(cè)出來(lái)。這是由于在高電場(chǎng)中瓜子殼實(shí)質(zhì)是一個(gè)“電泳池”，帶有不同電荷的物質(zhì)向相反方向移動(dòng)，使目標(biāo)化合物從土壤中解吸附，被溶劑快速提取出來(lái)，得到了較高的靈敏度。

2.3 馬鈴薯中生物堿分析

α-卡茄堿是馬鈴薯發(fā)芽、變綠、潰爛后產(chǎn)生的一種有毒物質(zhì)，人體攝入0.2～0.4 g即可引起中毒，過(guò)量攝入可致命，其結(jié)構(gòu)示于圖6。每100 g鮮重馬鈴薯中的茄堿含量，嫩芽高達(dá)500 mg，外皮達(dá)30～64 mg，全塊莖(去芽及去皮后)約7.5～10 mg。目前，檢測(cè)茄堿最常用的方法是高效液相色譜法[13]，需要對(duì)馬鈴薯進(jìn)行榨汁提取、分離提純等前處理過(guò)程。

圖6 α-卡茄堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.6 Chemical structure of α-caconine

本實(shí)驗(yàn)取2份0.1 g馬鈴薯芽，其中1份削成薄片并切出尖端，置于銅片上，滴入0.2 mL甲醇，施加高電壓用于直接電噴霧法[3]檢測(cè)，其質(zhì)譜圖示于圖7a；另1份采用在線提取瓜子殼電噴霧法分析，滴入0.2 mL甲醇，其質(zhì)譜圖示于圖7b。兩種電離方法均可得到α-卡茄堿(m/z852)質(zhì)譜峰，但信號(hào)強(qiáng)度分別為6 580、139 473，相差2個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明樣品在直接電噴霧中的電離效果弱于在線提取瓜子殼電噴霧。這是因?yàn)橹苯与婋x時(shí)只有樣品表面的目標(biāo)化合物被離子化；而在線提取瓜子殼電噴霧中的樣品已經(jīng)被壓碎，其內(nèi)部目標(biāo)化合物同樣可以被提取出來(lái)，因此在線提取瓜子殼電噴霧法的靈敏度更高。

圖7 馬鈴薯芽的直接電噴霧質(zhì)譜圖(a)和在線提取瓜子殼電噴霧質(zhì)譜圖(b)Fig.7 Mass spectra of potato sprouts using direct ionization mass spectrometry (a) and OE-SSH-ESI-MS (b)

另取1 g馬鈴薯芽，攪碎拌勻，分別稱取0.001、0.01、0.1 g馬鈴薯芽樣品，放在瓜子殼上，均注入0.2 mL甲醇，獲得的質(zhì)譜圖示于圖8。可以發(fā)現(xiàn)，得到的譜圖中α-卡茄堿的準(zhǔn)分子離子m/z852均為最高峰，且3份樣品的信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯數(shù)量級(jí)差別，說(shuō)明用少量樣品即可完成檢測(cè)，靈敏度較高，可以用于質(zhì)譜成像分析。

圖8 0.001 g(a)、0.01 g(b)和0.1 g(c)馬鈴薯芽的在線提取瓜子殼電噴霧質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of 0.001 g (a),0.01 g (b) and 0.1 g (c) potato sprouts using OE-SSH-ESI-MS

以馬鈴薯芽為中心，測(cè)定α-卡茄堿在馬鈴薯不同部位的分布，其信號(hào)強(qiáng)度示于圖9?？梢?jiàn)，在表皮發(fā)芽的部位信號(hào)最強(qiáng)，隨著距離變遠(yuǎn)，信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱；其次，馬鈴薯內(nèi)部質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度降低比表面快。這說(shuō)明α-卡茄堿主要存在于發(fā)芽處，并且離芽越遠(yuǎn)含量越低；其次，α-卡茄堿主要存在于表皮上，內(nèi)部含量較低。

圖9 馬鈴薯中不同位置的α-卡茄堿信號(hào)強(qiáng)度Fig.9 Signal intensity of α-caconine at different positions in potato

3 結(jié)論

本研究將在線提取和電噴霧質(zhì)譜結(jié)合，無(wú)需樣品前處理，實(shí)現(xiàn)了樣品的高通量檢測(cè)。相較于直接電離法只能分析樣品表面成分，該方法可將樣品內(nèi)部目標(biāo)化合物高效率地提取出來(lái)，具有更高的靈敏度。在α-卡茄堿檢測(cè)中，利用在線提取瓜子殼電噴霧裝置分析了其在馬鈴薯中的空間分布，檢出限可達(dá)0.001 g，表明該裝置通過(guò)適當(dāng)?shù)娜硬僮鳎梢詰?yīng)用于質(zhì)譜成像。同時(shí)，該裝置操作簡(jiǎn)便，瓜子殼簡(jiǎn)單易得，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的快速檢測(cè)。