何源峰，苗 慧，朱龍平，陳 寶

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

血清白蛋白是一種球狀蛋白[1]，是人血液中含量最豐富的蛋白質[2]，在藥物的運輸、分布和代謝中起著至關重要的作用[3]。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)與人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)具有高度的同源性和76%的結構相似性[4]，且價格便宜、易獲取，常被用作模型蛋白。因此，研究藥物與BSA的相互作用，有助于了解其在體內的運輸和分布情況，對于闡明藥物的作用機制具有重要的意義。

柚皮素的結構示于圖1，它是一種重要的黃酮類化合物，存在于各種柑橘類水果、西紅柿和葡萄中[5]，具有多種藥理作用，包括抗癌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成和血管擴張等[6]。盡管柚皮素具有多種藥理活性，但其對血漿蛋白的影響尚不清楚。

圖1 柚皮素化學結構Fig.1 Chemical structure of naringenin

目前已有多種研究蛋白-配體相互作用的分析方法，如熒光光譜法、圓二色光譜法、等溫滴定量熱法、表面等離子體共振光譜法和核磁共振波譜法[7-9]等。但這些方法存在一定的缺陷，如樣品消耗量大；分析時間長；在分析之前需要對蛋白質或配體進行標記、固定，容易導致偏差反應等。非變性質譜(native mass spectrometry)利用電噴霧電離(ESI)軟電離技術將完整的蛋白質-配體復合物從液相轉移到氣相，該過程保持了較弱的相互作用，保留了生物大分子的結構和生物功能[10]。非變性質譜具有樣品消耗量少、無需標記、簡便、快速、靈敏等優(yōu)點[11]，近年來已成功應用于蛋白質與配體之間的相互作用研究[12-15]。

本研究擬利用非變性質譜法研究BSA與柚皮素的相互作用，快速得到二者的相互作用方式、化學計量比、平衡解離常數(shù)、結合動力學等信息，希望為柚皮素的進一步開發(fā)和應用提供數(shù)據(jù)基礎，為其他藥物與血清白蛋白的相互作用研究提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Synapt G2-Si HDMS納升電噴霧-四極桿-離子淌度-飛行時間質譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；P-97毛細管拉制儀：美國Sutter Instruments公司產(chǎn)品；Milli-Q Advantage A10超純水機：德國Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

BSA：美國Sigma公司產(chǎn)品；柚皮素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；醋酸銨、甲酸：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲醇：美國Honeywell公司產(chǎn)品；硼硅酸毛細管：美國Sutter Instrument公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

精密稱取適量的BSA，用超純水配制成50 μmol/L母液，備用。取適量的BSA母液，用200 mmol/L醋酸銨溶液稀釋到5 μmol/L。

精密稱取適量的柚皮素，用甲醇配制成3 mmol/L母液，備用。用200 mmol/L醋酸銨溶液將柚皮素稀釋到100 μmol/L。

將BSA與柚皮素按照物質的量比1∶3混合，用200 mmol/L醋酸銨溶液稀釋，蛋白最終濃度為2.5 μmol/L。

2.2 質譜進樣針的制備

通過P-97毛細管拉制儀對外徑為1.0 mm、內徑為0.58 mm的硼硅酸毛細管進行拉制得到納噴針，具體參數(shù)為：Heat=500，Pull=0，VEL=35，TIME=250。

2.3 非變性質譜分析

用移液槍吸取3 μL蛋白復合物溶液，推入自制納噴針中，插入導電鉑絲，上樣，經(jīng)質譜儀分析。根據(jù)蛋白復合物信號的強弱及分辨率，選擇合適的儀器參數(shù)。主要參數(shù)如下：納升電噴霧離子源 (nESI)，正離子模式，毛細管電壓(capillary voltage)1.0 kV，錐孔電壓100 V，源偏移(source offset)80 V，源溫度37 ℃，捕獲氣體流速3 mL/min，詳細參數(shù)列于表1。

表1 詳細儀器參數(shù)Table 1 Detailed instrument parameters

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Waters公司的Masslynx V4.1和MaxEnt軟件進行數(shù)據(jù)處理。

3 結果與討論

3.1 質譜條件優(yōu)化

本研究系統(tǒng)地考察了關鍵儀器參數(shù)對BSA-柚皮素復合物測定的影響，發(fā)現(xiàn)錐孔電壓、源溫度以及捕獲氣體流速對復合物的測定具有顯著影響。

通過考察不同錐孔電壓的測定結果，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內，隨著錐孔電壓的升高，蛋白及其復合物峰的分辨率越來越高，示于圖2。當錐孔電壓為20、60 V時，由于溶劑化效應的影響，蛋白復合物與溶液中的醋酸銨等形成非特異性加合物，質譜峰右移，圖譜分辨率低；當錐孔電壓為100 V時，蛋白復合物峰的豐度及分辨率最高；當錐孔電壓為140 V時，蛋白復合物發(fā)生源內裂解，其質譜峰完全消失。因此，選擇100 V作為最佳錐孔電壓。

注：P表示BSA；PL表示BSA-柚皮素復合物圖2 不同錐孔電壓下的BSA-柚皮素復合物質譜圖Fig.2 Mass spectra of BSA-naringenin complex under different sample cone voltages

本實驗分別考察了37、80、120 ℃時蛋白復合物的豐度，結果示于圖3。37 ℃時，蛋白復合物的豐度最高，隨著溫度升高，蛋白復合物的豐度逐漸降低，說明源溫度對BSA-柚皮素復合物的影響較大，可能是高溫容易使蛋白發(fā)生去折疊[16]，從而導致小分子從結合口袋脫落。因此，選擇37 ℃作為最佳源溫度。

圖3 不同源溫度下的BSA-柚皮素復合物質譜圖Fig.3 Mass spectra of BSA-naringenin complex under different source temperatures

實驗進一步考察了捕獲氣體流速對蛋白及其復合物分辨率的影響，結果示于圖4?？梢?，當捕獲氣體流速為0 mL/min時，蛋白及其復合物峰的分辨率較低，譜圖不平滑；當捕獲氣體流速為3 mL/min時，分辨率顯著提高；當捕獲氣體流速超過3 mL/min時，分辨率未見顯著變化。因此，選擇3 mL/min作為最佳的捕獲氣體流速。

圖4 不同捕獲氣體流速下的BSA-柚皮素復合物質譜圖Fig.4 Mass spectra of BSA-naringenin complex under different flow rates of trap gas

3.2 BSA復合物的ESI-MS分析

空白BSA和物質的量比1∶3的BSA-柚皮素復合物的質譜圖示于圖5a，其中m/z3 908、4 153、4 430和4 746處的峰分別代表BSA的+17、+16、+15和+14電荷態(tài)，表明BSA處于天然折疊狀態(tài)[10]。此外，m/z3 924、4 170、4 448和4 766處的峰分別代表BSA-柚皮素1∶1復合物的+17、+16、+15和+14電荷態(tài)；m/z4 187與4 466處的峰分別代表BSA-柚皮素1∶2復合物的+16與+15電荷態(tài)。進一步對BSA及BSA-柚皮素復合物進行去卷積處理，得到的分子質量信息示于圖5b，其中66 432 u為BSA的平均分子質量，66 705 u和66 977 u分別代表化學計量比1∶1和1∶2的BSA-柚皮素復合物的平均分子質量。

圖5 BSA與BSA-柚皮素復合物的多電荷(a)和去卷積(b)質譜圖Fig.5 ESI-MS spectra of multiply charged (a) and deconvoluted (b) of BSA and BSA-naringenin complex

為了確定柚皮素與BSA 的相互作用方式，向BSA-柚皮素復合物溶液中加入等體積的甲醇以及1%甲酸，誘導BSA復合物發(fā)生去折疊(變性)。結果表明，分子質量為66 705 u和66 977 u的BSA-柚皮素復合物峰完全消失，僅剩分子質量為66 430 u的BSA峰，說明柚皮素是以非共價方式與BSA發(fā)生相互作用，示于圖6。

圖6 BSA-柚皮素復合物去折疊后的質譜圖Fig.6 Mass spectrum of BSA-naringenin complex after unfolding

3.3 平衡解離常數(shù)

通過直接ESI-MS法測定BSA-柚皮素復合物的平衡解離常數(shù)(Kd)，該方法是基于電噴霧電離過程中將蛋白質溶液轉化為氣相離子，當配體與蛋白質相比足夠小時，配體結合蛋白的大小和表面特性與游離蛋白相似，因此，氣相中測定的離子豐度比可以代表平衡濃度比[17-18]。參照公式(1)～(4)可計算Kd1和Kd2，其中，[P0]表示蛋白總濃度，[P]表示游離蛋白濃度，[PL1]、[PL2]分別表示1∶1和1∶2蛋白-配體復合物濃度，R為蛋白-配體復合物與游離蛋白濃度比，[L0]表示小分子總濃度，∑IP表示游離蛋白總豐度，∑IPL1、∑IPL2表示配體結合蛋白總豐度。

(1)

(2)

(3)

(4)

使用上述方法計算化學計量比1∶1和1∶2的 BSA-柚皮素復合物的Kd1和Kd2。結果顯示，Kd1為(7.82±0.03) μmol/L，Kd2為(9.63±0.02) μmol/L，與基于熒光光譜法測得的Kd值(7.46[19]、19.17[5]μmol/L)一致，說明該方法準確、可靠。

3.4 結合動力學

將BSA與柚皮素分別混合5、10、20、40 min，經(jīng)質譜分析，結果顯示：孵育不同時間，蛋白復合物與游離蛋白的豐度比未見顯著變化，說明柚皮素與BSA形成非共價復合物的速度非?？欤? min內基本達到飽和，示于圖7。

圖7 BSA與柚皮素孵育不同時間的質譜圖Fig.7 Mass spectra of BSA and naringenin incubated under different time

4 結論

本研究基于非變性質譜法考察了BSA與柚皮素的相互作用，結果表明，BSA與柚皮素形成了非共價復合物且親和力較強，其化學計量比為1∶1和1∶2。結合動力學結果顯示，柚皮素與BSA形成非共價復合物的速度非?？臁Ｔ摲椒ň哂袩o需標記、樣品消耗量小、簡便快速、靈敏等優(yōu)點，可為其他藥物和血清白蛋白的相互作用研究提供參考。