賈金茹，彭 博，李 婷，劉文靜，李 菡，李 波，趙云芳，宋月林

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029；2.安利(中國)植物研發(fā)中心，江蘇 無錫 214145)

枸杞子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其甘平而潤、性滋補(bǔ)，《本草綱目》稱其為“平補(bǔ)之藥”。《中國藥典(2020版)》規(guī)定，枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，用于虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽痿遺精、內(nèi)熱消渴等病癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，枸杞子具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、保護(hù)神經(jīng)[5]、降血糖[6]等多種藥理活性。枸杞子不僅是我國常用的滋補(bǔ)類中藥，而且在許多國家和地區(qū)也作為功能性食品使用。由于巨大的市場需求，在我國的寧夏、甘肅、青海等地大規(guī)模栽培寧夏枸杞，年產(chǎn)量20萬噸以上[7]，這給枸杞子樣品的檢測分析帶來了極大挑戰(zhàn)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)已成為分析中藥等復(fù)雜體系化學(xué)成分組成的主要工具[8]。近年來，色譜技術(shù)快速發(fā)展，特別是超高效液相色譜(UPLC)[9-10]和亞微米級色譜填料[11-12]的出現(xiàn)，使液相分析通量顯著提高，單次分析所需時間可降到30 min以內(nèi)，甚至10 min以內(nèi)，但依然難以滿足大規(guī)模樣品分析的要求，且不穩(wěn)定化學(xué)成分在與色譜填料接觸的過程中可能發(fā)生降解。

數(shù)據(jù)依賴性采集(DDA)和數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)是用于獲取多級質(zhì)譜信息(一般為MS2譜圖)最常用的2種模式[13]。DDA能夠明確地歸屬M(fèi)S2質(zhì)譜信號，但在色譜共流出情況下，難以全面采集所有化學(xué)成分的MS2圖譜。DIA與DDA相反，其優(yōu)點在于能夠全面采集MS2圖譜，但難以歸屬碎片離子。在理想的色譜分離情況下，DDA和DIA均能實現(xiàn)MS2圖譜的全面采集和母離子的歸屬；而在無色譜分離情況下，氣態(tài)分段技術(shù)(GPF)[14-15]的出現(xiàn)為通過直接注射(DI)建立復(fù)雜樣品MS1-MS2數(shù)據(jù)列表提供了可能。作為最常用的GPF技術(shù)，SWATH[16]和多級質(zhì)譜全掃描(MS/MSALL)[17]方法能將整個母離子流分割成寬度為25 u或者1 u的連續(xù)質(zhì)譜窗。對于每個質(zhì)譜窗，均采用DIA模式全面采集碎片離子信息，大大降低了碎片離子歸屬的難度。特別是MS/MSALL技術(shù)，首先快速采集樣品的MS1譜圖，然后將整個離子隊列分成一系列連續(xù)單位質(zhì)量(1 u)窗口，依次進(jìn)入碰撞池，實現(xiàn)每個表觀質(zhì)量數(shù)的MS2譜圖采集。理論上，只要不是同分異構(gòu)體，或者具有相同表觀質(zhì)量數(shù)的化合物，均可以實現(xiàn)良好的分離。采用無色譜分離的DI進(jìn)樣模式，可以根據(jù)采集MS2圖譜所需的時間設(shè)定進(jìn)樣時間，為所有二級圖譜的采集提供了時間保障。

基于此，為快速、全面闡明枸杞子的化學(xué)成分組，本研究擬利用DI-MS/MSALL技術(shù)對枸杞子的提取物進(jìn)行分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

TripleTOF 5600+質(zhì)譜儀：美國Sciex公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及PeakviewTM1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；冷凍干燥機(jī)：德國Christ公司產(chǎn)品；XS105型電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；超聲波清洗器：南京壘君達(dá)公司產(chǎn)品；離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國 Millipore 公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

枸杞子：采自寧夏中衛(wèi)，經(jīng)北京大學(xué)屠鵬飛教授鑒定為藥材茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實；甲醇：質(zhì)譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；乙酸乙酯：分析純，北京化工公司產(chǎn)品；超純水：由實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 樣品制備

取適量枸杞子，置于液氮中冷凍1 min，搗碎，真空冷凍干燥機(jī)干燥后粉碎，過2號篩。精密稱取約1.0 g粉末，置于具塞三角瓶中，以50 mL 70%甲醇-水溶液超聲提取40 min，靜置放冷，用70%甲醇-水溶液補(bǔ)充失重。室溫條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，減壓回收溶劑至近干，向其中加入25 mL水，待完全溶解后倒入分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯溶液，振搖3 min，靜置分層，取乙酸乙酯層。重復(fù)上述操作3次，合并乙酸乙酯層溶液，減壓回收溶劑至近干，加入40 mL甲醇溶液使其完全溶解，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得待測樣品。

1.4 質(zhì)譜條件

蠕動泵以10 μL/min將枸杞子提取液注入離子源，持續(xù)5 min，隨后以100 μL/min向管路中注入甲醇溶液，沖洗管路2 min。

電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子掃描模式；一級質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 000，二級質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 000；離子噴霧電壓5 500/-4 500 kV；噴霧氣(GS1)壓力30 MPa；輔助加熱氣(GS2)壓力30 MPa；氣簾氣(CUR)壓力25 MPa；離子化溫度(TEM)200 ℃；碰撞能量35/-35 eV，碰撞能量擴(kuò)展(CES)15 eV；去簇電壓(DP)40/-40 V。

2 結(jié)果與討論

采用DI-MS/MSALL技術(shù)分析枸杞子提取物，得到正、負(fù)離子模式下的MS1譜圖，分別示于圖1a、1c。正離子模式下，主要的MS1信號有m/z126.054 4、149.018 3、180.095 9、205.079 2、279.150 7、301.131 5、317.105 1、579.274 1等；負(fù)離子模式下，主要的MS1信號有m/z119.050 5、137.024 4、163.041 0、179.056 0、210.077 0、255.232 9、279.232 6、339.232 0、609.144 5等。采用PeakviewTM軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，以相對豐度0.1%進(jìn)行碎片過濾，得到正、負(fù)離子模式下MS2碎片離子熱圖信息，示于圖1b、1d。

以負(fù)離子模式下m/z255～256質(zhì)量窗口為例，該窗口產(chǎn)生的碎片離子主要包括m/z165.057 8、137.024 6和119.050 5等，示于圖1e。結(jié)合MS1譜圖可知，該窗口出現(xiàn)唯一的母離子m/z255.232 9，因此將上述碎片離子歸屬為其子離子，進(jìn)而實現(xiàn)MS1-MS2數(shù)據(jù)列表的構(gòu)建。

根據(jù)得到的MS1和MS2信息，并結(jié)合Mass-Bank、HMDB、Metlin、PubChem等數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)報道的各類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，從枸杞子中初步鑒定出38個化合物，包括1個氨基酸類、19個有機(jī)酸類、2個糖脂類、6個苯丙素類、1個黃酮類、6個生物堿類以及3個酰胺類化合物，結(jié)果列于表1。

2.1 苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

從枸杞子中鑒定出6個苯丙素類化合物，包括2個香豆素類化合物(3和8)和4個簡單苯丙素類化合物(9、10、22和29)。根據(jù)多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，對2類苯丙素類化合物的質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行推導(dǎo)，并對MS1、MS2信號進(jìn)行歸屬。

注：a,c.MS1譜圖；b,d.MS2碎片離子熱圖；e.m/z 255～256質(zhì)量窗口的MS2質(zhì)譜圖圖1 正(a,b)、負(fù)(c,d)離子模式下，枸杞子提取物DI-MS/MSALL的多級質(zhì)譜圖Fig.1 Tandem mass spectra of Lycii Fructus extract collected by DI-MS/MSALL under positive (a,b) and negative (c,d) ion modes

2.1.1香豆素類化合物 香豆素類化合物是以苯駢α-吡喃酮為結(jié)構(gòu)母核，且在α-吡喃酮環(huán)上具有羥基、甲氧基、糖基等含氧官能團(tuán)的取代。負(fù)離子模式下，該類化合物的準(zhǔn)分子離子通常以[M-H]-形式存在，碎片離子主要通過發(fā)生CO(28 u)、CO2(44 u)、葡萄糖殘基(C6H10O5，162 u)和鼠李糖殘基(C6H10O4，146 u)等基團(tuán)的中性丟失形成。由于在α-吡喃酮環(huán)上常見甲氧基取代，因此，還會進(jìn)一步丟失甲基自由基(CH3·，15 u)。

以化合物8為例，負(fù)離子模式下的MS1譜圖顯示準(zhǔn)分子離子為m/z191.034 8[M-H]-，預(yù)測其分子式為C10H8O4(誤差為-1×10-6)，主要的碎片離子為m/z176.012 2、148.017 3、120.021 6和104.027 1，其MS2譜圖示于圖2a。根據(jù)預(yù)測的元素組成和相關(guān)文獻(xiàn)[20]，并結(jié)合上述質(zhì)譜裂解規(guī)律，對碎片離子的產(chǎn)生途徑進(jìn)行歸屬，其中豐度最高的碎片離子m/z176.012 2[M-H-CH3·]-·是由母離子脫去甲基自由基(CH3·，15 u)產(chǎn)生的。該碎片離子進(jìn)一步連續(xù)丟失CO(28 u)，產(chǎn)生碎片離子m/z148.017 3[M-H-CH3·-CO]-·和m/z120.021 6[M-H-CH3·-2CO]-·。此外，碎片離子m/z104.027 1[M-H-CH3·-CO2-CO]-·是由m/z176.012 2丟失1分子CO2(44 u)和1分子CO(28 u)生成。根據(jù)上述信息，將[M-H]-m/z191.034 8的化合物初步鑒定為東莨菪素(scopoletin)或異東莨菪素(isoscopoletin)。由于枸杞子中存在這對同分異構(gòu)體，故化合物8的信號是由這對同分異構(gòu)體同時產(chǎn)生的。以東莨菪素為例，推測的質(zhì)譜裂解途徑示于圖2b。

圖2 東莨菪素的二級質(zhì)譜圖(a)及其質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.2 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of scopoletin

2.1.2簡單苯丙素類化合物 簡單苯丙素類化合物是以C6～C3為基本骨架，一般具有苯酚結(jié)構(gòu)。負(fù)離子模式下，該類化合物的準(zhǔn)分子離子通常以[M-H]-形式存在。在二級質(zhì)譜圖中，母離子通常會發(fā)生H2O(18 u)、CO(28 u)和CO2(44 u)等中性丟失產(chǎn)生碎片離子。此外，由于該類化合物具有酚羥基、羧基等含氧官能團(tuán)，與糖上的羥基脫水縮合形成苷類化合物，因此，常見糖殘基的中性丟失，例如葡萄糖殘基(C6H10O5，162 u)和木糖殘基(C5H8O4，132 u)等。

以化合物22為例，負(fù)離子模式下的MS1譜圖顯示準(zhǔn)分子離子為m/z325.092 3[M-H]-，預(yù)測其分子式為C15H18O8(誤差為-1.8×10-6)，主要的碎片離子有m/z163.039 2、145.030 3和119.049 9，其MS2譜圖示于圖3a。根據(jù)預(yù)測的元素組成和相關(guān)文獻(xiàn)[20]，并結(jié)合上述質(zhì)譜裂解規(guī)律，對碎片離子的產(chǎn)生途徑進(jìn)行歸屬。其母離子m/z325.092 3[M-H]-首先中性丟失1分子葡萄糖殘基(C6H10O5，162 u)產(chǎn)生碎片離子m/z163.039 2[M-H-C6H10O5]-，該碎片離子進(jìn)一步中性丟失1分子H2O(18 u)產(chǎn)生碎片離子m/z145.030 3[M-H-C6H10O5-H2O]-，或中性丟失1分子CO2(44 u)產(chǎn)生碎片離子m/z119.049 9[M-H-C6H10O5-CO2]-。因此，根據(jù)上述信息初步推測[M-H]-m/z325.092 3的化合物為對香豆素-O-葡萄糖苷，其可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖3b。

圖3 對香豆素-O-葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖(a)及其質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.3 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of p-coumaric acid-O-glycosides

2.2 生物堿類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

據(jù)文獻(xiàn)[20]報道，目前已從枸杞子中分離得到72個生物堿類化合物，主要包括莨菪烷類、咪唑類、哌啶類和吡咯類等。本研究從枸杞子中初步鑒定出6個生物堿類化合物，其中包括4個吡咯類生物堿(11～14)、甜菜堿(32)及1個其他類生物堿(33)。通過多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)推測吡咯類生物堿的質(zhì)譜裂解途徑，并對MS1、MS2信號進(jìn)行歸屬。

枸杞子中吡咯類生物堿的基本結(jié)構(gòu)為五元含氮雜環(huán)，其吡咯環(huán)1位氮原子上存在丁酸、丁酸甲酯等基團(tuán)取代，且在吡咯環(huán)的2位和5位通常具有羥甲基、甲氧基甲基、醛基等基團(tuán)取代。

該類化合物在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰通常以[M-H]-形式存在，碎片離子主要是由吡咯環(huán)1位氮原子處支鏈的中性丟失產(chǎn)生，例如丁酸基團(tuán)(C4H6O2，86 u)、丁酸甲酯基團(tuán)(C5H9O2，100 u)等。此外，由于吡咯環(huán)上的2位和5位通常有羥甲基、醛基等基團(tuán)取代，因此會進(jìn)一步中性丟失CH2O(30 u)、CO(28 u)等產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子。

以化合物13為例，負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z210.077 0[M-H]-，預(yù)測其分子式為C10H13NO4(誤差為-0.9×10-6)，主要的碎片離子有m/z124.040 0、94.029 8和66.034 6，其MS2譜圖示于圖4a。結(jié)合預(yù)測的元素組成和上述質(zhì)譜裂解規(guī)律，對碎片離子的產(chǎn)生途徑進(jìn)行歸屬，碎片離子m/z124.040 0[M-H-C4H6O2]-是由母離子在吡咯環(huán)上N原子處發(fā)生斷裂丟失C4H6O2(86 u)形成的，該碎片離子繼而丟失CH2O(30 u)、CO(28 u)，分別得到碎片離子m/z94.029 8[M-H-C4H6O2-CH2O]-和m/z66.034 6[M-H-C4H6O2-CH2O-CO]-。此外，其母離子還可脫去1分子甲酸(46 u)產(chǎn)生碎片離子m/z164.040 8[M-H-HCOOH]-。因此，參考相關(guān)文獻(xiàn)[20]以及數(shù)據(jù)庫檢索，初步推測[M-H]-m/z210.077 0為4-[2-甲?；?5-(羥甲基)-1H-吡咯-1-基]-丁酸，其可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖4b。

圖4 4-[2-甲?；?5-(羥甲基)-1H-吡咯-1-基]-丁酸的二級質(zhì)譜圖(a)及其質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.4 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of 4-[2-formyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]-butanoic acid

2.3 酰胺類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

本研究基于DI-MS/MSALL技術(shù)從枸杞子中鑒定出3個酰胺類化合物，包括1個非多胺型酚酰胺類化合物(36)和2個亞精胺型酚酰胺類化合物(37和38)。根據(jù)該類化合物的多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)[21]推測其質(zhì)譜裂解途徑，并對各MS1、MS2信號進(jìn)行歸屬。

2.3.1非多胺型酚酰胺類化合物 非多胺型酚酰胺大多具有酪胺結(jié)構(gòu)，正離子模式下的裂解首先主要發(fā)生在酰胺鍵處，中性丟失酪胺分子(C8H11NO，137 u)產(chǎn)生正離子信號，如咖啡?；?m/z163)、二氫咖啡?；?m/z165)等。由于其結(jié)構(gòu)上存在羥基、甲氧基等取代基團(tuán)，因此經(jīng)酰胺鍵斷裂產(chǎn)生的正離子信號會進(jìn)一步發(fā)生CO(28 u)、H2O(18 u)、CH3·(15 u)、CH3OH(32 u)等基團(tuán)丟失。

以化合物36為例，正離子模式下的MS1譜圖顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z314.138 4[M+H]+，預(yù)測其分子式為C18H19NO4(誤差為-0.8×10-6)，主要的碎片離子有m/z177.048 4、162.084 5和121.060 5等，其MS2譜圖示于圖5a。根據(jù)預(yù)測的元素組成并結(jié)合上述質(zhì)譜裂解規(guī)律，對碎片離子的產(chǎn)生途徑進(jìn)行推測。由于該類化合物結(jié)構(gòu)中大多具有酪胺結(jié)構(gòu)，容易在酰胺鍵處斷裂脫去1分子酪胺(C8H11NO，137 u)產(chǎn)生m/z177.048 4[M+H-C8H11NO]+碎片離子，該碎片離子進(jìn)一步脫去1分子CO(28 u)和甲基自由基(CH3·，15 u)，分別產(chǎn)生碎片離子m/z149.054 9[M+H-C8H11NO-CO]+和162.084 5[M+H-C8H11NO-CH3·]+·。此外，酪胺側(cè)C-N鍵斷裂產(chǎn)生碎片離子m/z121.060 5[M+H-C10H11NO3]+。根據(jù)上述信息推測[M+H]+m/z314.138 4為N-反式阿魏酰酪胺，其可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖5b。

圖5 N-反式阿魏酰酪胺的二級質(zhì)譜圖(a)及其質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.5 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of N-trans-feruloyl tyramine

2.3.2亞精胺型酚酰胺類化合物 亞精胺型酚酰胺是以亞精胺為結(jié)構(gòu)骨架，含有2個氨基和1個亞氨基，且多具有咖啡?；?m/z163)、二氫咖啡?；?m/z165)等基團(tuán)。與非多胺型酚酰胺一致，亞精胺型酚酰胺首先在酰胺鍵處發(fā)生斷裂得到?；x子，進(jìn)一步發(fā)生CO(28 u)中性丟失。氨基側(cè)正離子則在氨基處發(fā)生一系列中性丟失，如NH3(17 u)、C4H9N(71 u)、CO(28 u)、C3H6(42 u)、CH3N(29 u)等[21]。

以化合物37為例，正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z472.243 8[M+H]+，預(yù)測化合物的分子式為C25H33N3O6(誤差為-0.8×10-6)，主要的碎片離子有m/z310.201 7、293.176 0、220.089 4、163.032 9等，其MS2譜圖示于圖6a。由于該類化合物的結(jié)構(gòu)骨架為亞精胺，其中含有2個氨基和1個亞氨基，可在酰胺鍵處斷裂產(chǎn)生m/z163.032 9[M+H-C16H27N3O3]+和m/z310.201 7[M+H-C9H6O3]+碎片離子。碎片離子m/z310.201 7進(jìn)而在氨基處發(fā)生斷裂，中性丟失NH3(17 u)形成碎片離子m/z293.176 0[M+H-C9H6O3-NH3]+；而碎片離子m/z220.089 4[M+H-C13H20N2O3]+則是由母離子在亞氨基側(cè)C—C鍵斷裂形成。因此，根據(jù)上述信息推測[M+H]+m/z472.243 8為N1-咖啡酰-N3-二氧咖啡酰亞精胺，其可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖6b。

圖6 N1-咖啡酰-N3-二氧咖啡酰亞精胺的二級質(zhì)譜圖(a)及其質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.6 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of N1-caffeoyl-N3-dihydrocaffeoyl spermidine

3 結(jié)論

本研究采用DI-MS/MSALL技術(shù)表征枸杞子化學(xué)成分組，共鑒定出38個化合物，可為枸杞子藥材的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。該技術(shù)將直接注射質(zhì)譜高通量優(yōu)勢與Q-TOF MS高靈敏度、高分辨率、強(qiáng)特異性的優(yōu)勢結(jié)合，實現(xiàn)中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分的快速分析，為中藥定性分析和質(zhì)量評價提供有效的分析工具。但DI-MS/MSALL技術(shù)也存在一定的局限性，當(dāng)設(shè)定的檢測窗口中存在同分異構(gòu)體時，無法對其子離子進(jìn)行歸屬，難以區(qū)分中藥中廣泛存在的同分異構(gòu)體類化合物。將該方法與常用的同分異構(gòu)體區(qū)分方法聯(lián)用，如在線能量分辨質(zhì)譜等[22]，可提高中藥化學(xué)成分輪廓分析的準(zhǔn)確性。