張雨婷，王春國，鄧欣祺，閆興麗，劉窈玉，蘭 宇，王宇航，王家平，金重先，石晉麗，張碩峰

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京中醫(yī)藥研究院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488；3.北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102488；4.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 102488)

燈盞細辛注射液是燈盞細辛經(jīng)提取精煉而成的滅菌水溶液，具有活血祛瘀、通絡(luò)止痛之功效[1]，在臨床上用于治療缺血性中風、冠心病、心絞痛等疾病[2-6]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，燈盞細辛注射液具有舒張血管，改善微循環(huán)，提高心腦供血；調(diào)節(jié)血脂，降低血液黏稠度，改善血液流變性；抑制血小板及紅細胞聚集，促進纖溶活性；清除氧自由基，對抗脂質(zhì)過氧化及缺血再灌注損傷等藥理作用[7-17]。

燈盞細辛化學成分研究始于20世紀70年代，目前，已從燈盞細辛藥材中檢測到80余種化學成分，其中黃酮類和咖啡酰酯類化合物是燈盞細辛注射液的主要化學成分[15-25]。但是，關(guān)于燈盞細辛注射液的化學成分尚缺乏系統(tǒng)研究。有報道使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)[26-27]對燈盞細辛注射液中的主要化學成分進行定性和定量測定，由于DAD對化合物結(jié)構(gòu)信息表征的有限性以及靈敏度的不足，無法實現(xiàn)標準品以外的化合物結(jié)構(gòu)鑒定。Zhou等[28]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法同時測定燈盞細辛注射液中9種主要生物活性成分；Wang等[23]建立了LC-DAD-ESI-MSn快速定性分析的方法，成功鑒定了燈盞細辛注射液中18種化合物；Zhang等[29]采用Q-TOF MS對燈盞細辛注射液進行快速分析，共鑒定了44種化合物，其中15種為首次報道。上述研究多采用低分辨質(zhì)譜或TOF質(zhì)譜，且化合物鑒定的數(shù)量和深度有待提高，而基于Orbitrap質(zhì)譜對燈盞細辛注射液的研究尚未見報道。

線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap MS)是將線性離子阱質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜結(jié)合的雜交型質(zhì)譜儀，具有離子阱質(zhì)譜的多級碎裂、Orbitrap的高質(zhì)量分辨能力和精確質(zhì)量數(shù)的優(yōu)勢，有助于定性分析復(fù)雜成分體系[30-31]。全球自然產(chǎn)物社會分子網(wǎng)絡(luò)(GNPS)是由 Watrous等[32]基于相關(guān)化合物的MS/MS碎片模式相似性創(chuàng)建的分子網(wǎng)絡(luò)，并率先應(yīng)用到微生物天然產(chǎn)物研究中。目前，GNPS已經(jīng)收錄了22 644個化合物和235 850個譜圖，其中分子網(wǎng)絡(luò)是GNPS平臺中主要的分析工具之一，通過計算MS/MS的相似性關(guān)系來創(chuàng)建結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)表，以反映串聯(lián)質(zhì)譜實驗中捕獲的分子多樣性。程桃芳等[33]綜述了基于GNPS的分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在中藥中的應(yīng)用進展。該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥化學成分的定性表征、定量表征、質(zhì)量控制以及中藥活性成分的分離制備等方面。

本研究擬采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn和分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對燈盞細辛注射液成分進行快速篩查和深度鑒定，并解析其可能存在的新成分，以形成一套較為完整的成分表征策略。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

LTQ-Oribitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品，配有熱噴霧離子源(HESI)、Xcalibur 2.1化學工作站；DionexUtimate 3000 UHPLC Plus Focused超高效液相色譜系統(tǒng)：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品，含二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器；Millipore Synergy UV型超純水機：美國Millipore公司產(chǎn)品；Sartorious BT 25S型萬分之一電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

燈盞細辛注射液(批號Z53021569)：云南生物谷藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；綠原酸、新綠原酸、飛蓬酯乙、野黃芩素和野黃芩苷等標準品：成都瑞芬思生物科技公司產(chǎn)品；0.22 μm微孔濾膜：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；甲酸、甲醇、乙腈等試劑：均為質(zhì)譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈溶液(B)；梯度洗脫條件：0～3 min(5%B)，3～45 min(5%～75%B)，45～45.1 min(75～5%B)，45.1～50 min(5%B)；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：35 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 正離子檢測模式：HESI離子源，溫度350 ℃，電離源電壓4 kV，毛細管電壓35 V，管透鏡電壓110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣壓力2.76×105Pa，輔助氣流速6.67 L/min；負離子檢測模式：HESI離子源，溫度350 ℃，電離源電壓3 kV，毛細管電壓35 V，管透鏡電壓110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣壓力2.07×105Pa，輔助氣流速3.34 L/min。

正、負離子數(shù)據(jù)采集均使用傅里葉變換高分辨全掃描方式(TF,Full scan,分辨率30 000)數(shù)據(jù)依賴性(data-dependent acquisistion)ddMS3，運用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎裂方式。

1.4 標準品溶液制備

精密稱取適量的綠原酸、新綠原酸、飛蓬酯乙、野黃芩素和野黃芩苷，配制成250 mg/L標準品溶液。

1.5 樣品溶液制備

取適量的燈盞細辛注射液，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準品的質(zhì)譜裂解行為

2.1.1咖啡酰酯類化合物 燈盞細辛注射液中咖啡酰酯類化合物主要包含咖啡酰-奎寧酸(CQA)、咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸(caffeoyl-2,7-anhydro-3-deoxy-2-octulopyranosonic acid,CDOA)、咖啡酰-2,7-脫氫-2-辛酮糖酸(caffeoyl-2,7-anhydro-2-octulosonic acid,COA)和咖啡酰-1-(2′-γ-吡喃酮，CPO)4類化合物，示于圖1。本文選取燈盞細辛CQA類代表化合物綠原酸和新綠原酸，CDOA類代表化合物飛蓬酯乙進行質(zhì)譜裂解行為分析。

圖1 燈盞細辛中4種咖啡酰酯衍生物母核Fig.1 Cores of caffeoyl ester derivatives identified in Erigeron breviscapus

綠原酸和新綠原酸均為1分子咖啡酸(caffeic acid)和1分子奎寧酸(quinic acid)形成的單咖啡酰酯類化合物。在CID裂解下，由于酯鍵的存在，2種化合物均會碎裂形成m/z191[M-Caffeoyl-H]-和m/z179 [Caffeic acid-H]-特征碎片離子，其中m/z191進一步碎裂形成m/z173[M-Caffeoyl-H2O-H]-碎片離子。由于綠原酸和新綠原酸是咖啡?；诳鼘幩崮负?位和3位的同分異構(gòu)體，所以兩個化合物的MS2和MS3碎片種類基本一致，示于圖2a、2b，主要區(qū)別是m/z191和m/z173豐度的大小，即綠原酸以m/z191為基峰，而新綠原酸以m/z173為基峰。

飛蓬酯乙為單咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸衍生物，在MS2中，咖啡酰酯鍵以不同形式斷裂生成m/z381 [M-Caffeoyl-H]-和m/z179 [Caffeic acid-H]-碎片離子。其中，m/z381為基峰，進一步CID碎裂，在MS3中連續(xù)中性丟失形成m/z363、337、293等碎片離子，并在譜圖的低分子質(zhì)量端形成m/z179 [Caffeic acid-H]-和m/z161 [Caffeic acid-H2O-H]-等碎片離子。

綜上，咖啡酰酯類化合物的質(zhì)譜碎裂規(guī)律主要圍繞酯鍵斷裂形成[M-Caffeoyl-H]-的母核碎片(如m/z191、381等)和[Caffeic acid-H]-的咖啡酸碎片為主。

注：a.綠原酸；b.新綠原酸；c.飛蓬酯乙圖2 主要咖啡酰酯類標準品MS2和MS3譜圖及碎裂途徑Fig.2 MS2,MS3 spectra and fragmentation pathways of major caffeoyl ester standards

2.1.2黃酮類化合物 4′,5,6,7-四羥基黃酮(野黃芩素)是燈盞細辛中重要的黃酮類母核，其糖苷鍵化合物野黃芩苷是燈盞細辛中含量最高的黃酮。

野黃芩苷經(jīng)CID裂解后，糖苷鍵碎裂，丟失1分子葡萄糖醛酸，形成4′,5,6,7-四羥基黃酮苷元，因此，野黃芩苷MS3與野黃芩素MS2的碎片基本一致，示于圖3a、3b。研究野黃芩素的MS2和MS3質(zhì)譜裂解行為發(fā)現(xiàn)，野黃芩素主要以發(fā)生RDA1,3裂解和中性丟失為主，形成m/z119、169、267、241、239、211、213、185等碎片離子。

注：a.野黃芩苷；b.野黃芩素圖3 主要黃酮類標準品MS2和MS3譜圖及碎裂途徑Fig.3 MS2,MS3 spectra and fragmentation pathways of major flavonoids standards

2.2 基于MS/MS關(guān)聯(lián)的分子網(wǎng)絡(luò)分析燈盞細辛注射液成分類別

在總結(jié)咖啡酰酯類(綠原酸、異綠原酸和飛蓬酯乙)和黃酮類(野黃芩素和野黃芩苷)標準品質(zhì)譜裂解規(guī)律的基礎(chǔ)上，進一步運用基于MS/MS關(guān)聯(lián)的分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)分析燈盞細辛注射液成分。分別使用綠原酸、異綠原酸、飛蓬酯乙、野黃芩素和野黃芩苷等標準品作為“種子”節(jié)點，基于MS/MS碎裂模式的相似性，發(fā)現(xiàn)燈盞細辛主要成分被聚為多個類別，其中與“種子”節(jié)點綠原酸、異綠原酸、飛蓬酯乙相關(guān)的成分被標記為粉紅色，與“種子”節(jié)點野黃芩素和野黃芩苷相關(guān)的成分被標記為綠色，示于圖4?；贛S/MS碎片及與“種子節(jié)點“的質(zhì)量差異進行注釋，主要簇被注釋為單咖啡?？鼘幩?monoCQAs)、雙咖啡?？鼘幩?diCQAs)、三咖啡酰奎寧酸(triCQAs)、單咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸(monoCDOAs)、雙咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸(diCDOAs)、三咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸(triCDOAs)以及黃酮類。

圖4 基于MS/MS關(guān)聯(lián)的燈盞細辛注射液分子網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Molecular network analysis based on MS/MS association in Erigeron breviscapus injection

2.3 燈盞細辛注射液中咖啡酰酯類化合物鑒定

2.3.1單咖啡酰酯類化合物鑒定

1) 單咖啡?？鼘幩嵋约把苌?/p>

根據(jù)高分辨質(zhì)譜精確分子質(zhì)量(質(zhì)量誤差≤5×10-6)的提取離子色譜(extracted ion chromatography,XIC)圖發(fā)現(xiàn)，與對照品綠原酸和新綠原酸元素組成(C16H18O9)一致的化合物共有8個，示于圖5a。其中，峰1～7具有MS/MS信息，其碎片離子均出現(xiàn)m/z191、179、173等咖啡酰和奎寧酸的特征碎片，由此推斷為單咖啡酰-奎寧酸類化合物；根據(jù)對照品綠原酸和新綠原酸，以及文獻保留時間[23,34-38]和MS/MS碎片，鑒定峰4～7分別為1-CQA、3-CQA、5-CQA、4-CQA，而峰1～3為從該植物中首次鑒定。

圖5 燈盞細辛中單咖啡酰酯類化合物的提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of monocaffeoyl ester compounds in Erigeron breviscapus

峰12(圖5c)和17(圖5e)的精確分子質(zhì)量分別為335.076 41、367.102 96，推測其元素組成為C16H15O8(質(zhì)量誤差1.13×10-6)和C17H19O9(質(zhì)量誤差1.33×10-6)。在MS/MS中，峰12主要以m/z161、135等咖啡酸特征碎片為主；峰17主要以m/z193等咖啡酸甲酯碎片為主。結(jié)合文獻[23,36-41]，推測峰12為3-O-咖啡酰-γ-奎尼內(nèi)酯，峰17為5-O-咖啡?；鼘幩峒柞?。

2) 單咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸以及衍生物

峰8～11(圖5b)的精確分子質(zhì)量為381.082 06，推測其元素組成為C17H17O10(質(zhì)量誤差分別為1.71×10-6、1.68×10-6、1.70×10-6、2.02×10-6)，在MS2中的碎片離子與飛蓬乙酯在MS3中的碎片離子基本一致，均含有m/z363、337、293、251、179、161等碎片離子，由此推斷峰8～11為單咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸及其同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻[34,38-39]及保留時間等信息，推測峰8～11分別為3-CDOA、4-CDOA、6-CDOA、9-CDOA，其中6-CDOA為從燈盞細辛及其注射液中首次鑒定。

3) 單咖啡酰-2,7-脫氫-2-辛酮糖酸及其衍生物

峰13～16(圖5d)的精確分子質(zhì)量為397.076 93，推測其元素組成為C17H17O11(質(zhì)量誤差分別為1.76×10-6、1.51×10-6、1.76×10-6、2.01×10-6)，MS2中的主要碎片離子為m/z335、293、235、179、161、135等。其中，m/z179、161、135等為咖啡酸特征碎片，推測峰13～16為咖啡酰衍生物。峰13～16的準分子離子與峰8～11相差16 u，碎片離子m/z335、235等與峰8～11的碎片離子m/z363、251等也相差16 u，由此推測化合物13～16為單咖啡酰-2,7-脫氫-2-辛酮糖酸及其同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻[34,38-39,42]及保留時間等信息，推測峰13～16分別為2-COA、3-COA、4-COA、9-COA，其中3-COA為從燈盞細辛及其注射液中首次鑒定。

4) 咖啡酰-1-(2′-γ-吡喃酮)

峰18元素組成為C20H19O11(圖5f)，根據(jù)文獻[34,39,43]和MS/MS碎片，鑒定其結(jié)構(gòu)為咖啡酰-1-(2′-γ-吡喃酮)燈盞花苷I(多舌飛蓬苷)。

2.3.2雙咖啡?？鼘幩犷惢衔镨b定

1) 雙咖啡?？鼘幩嵋约把苌?/p>

峰19～22(圖6a)的精確分子質(zhì)量為515.118 31，推測其元素組成為C25H23O12(質(zhì)量誤差分別為2.29×10-6、2.15×10-6、1.92×10-6、2.31×10-6)，在MS2中的碎片離子以m/z353為基峰，進一步CID裂解，在MS3中的碎片離子與峰1～7的MS2碎片基本一致。根據(jù)峰19～22的準分子離子與峰1～7的準分子離子相差C9H6O3(1分子咖啡?；?，推測峰19～22為diCQA及其同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻[23,34,36-37,39,41]及保留時間等信息，推測峰19～22分別為1,3-diCQA、1,4-diCQA、3,4-diCQA、1,5-diCQA。

圖6 燈盞細辛中雙咖啡酰酯類化合物的提取離子色譜圖Fig.6 Extracted ion chromatograms of dicaffeoyl ester compounds in Erigeron breviscapus

峰27～29(圖6e)的精確分子質(zhì)量為529.134 40，推測其元素組成為C26H25O12(質(zhì)量誤差分別為1.38×10-6、1.60×10-6、2.28×10-6)，與峰19～22相差14 u，由此推測峰27～29為diCQA的羥基甲基化結(jié)構(gòu)。與峰19～22相似，峰27～29在MS2中的碎片離子以m/z353為基峰，進一步佐證了上述為diCQA羥基甲基化結(jié)構(gòu)的推測，結(jié)合文獻[36,41,44-45]及保留時間等信息，鑒定峰27～29分別為3,4-O-二咖啡?？鼘幩峒柞?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞?。同理，峰30(C27H26O13)(圖6f)和峰31(C27H28O12)(圖6g)分別為1-O-甲基-3,5-O-雙咖啡?；鼘幩峒柞ズ惋w蓬酯A(acetyl-diCQA)。

2) 雙咖啡酰-2,7-脫氫-3-脫氧-2-辛酮糖酸以及衍生物

峰24(圖6c)的精確分子質(zhì)量為543.111 48，推測其元素組成為C26H23O13(質(zhì)量誤差-0.13×10-6)，其MS2和MS3與對照品飛蓬酯乙相同，鑒定峰24為飛蓬酯乙。峰32～34(圖6h)的精確分子質(zhì)量為705.167 08(質(zhì)量誤差分別為1.46×10-6、1.43×10-6、2.92×10-6)，推測其元素組成為C32H33O18，與飛蓬酯乙相差C6H6O6，由此推測峰32～34為diCDOA的葡萄糖苷，可能分別為3,9-diCDOA、3,4-diCDOA、4,9-diCDOA，其中3,9-diCDOA、3,4-diCDOA為從燈盞細辛和注射液中首次鑒定。

3) 雙咖啡酰-2,7-脫氫-2-辛酮糖酸及其衍生物

峰25、26(圖6d)的精確分子質(zhì)量為559.107 69，推測其元素組成為C26H23O14(質(zhì)量誤差分別為2.15×10-6、2.33×10-6)，在MS2中的主要碎片離子為m/z397、381等，進一步CID裂解，在MS3中的碎片離子與峰13～16的MS2碎片基本一致。根據(jù)峰13～16的準分子離子與峰25、26的準分子離子相差C9H6O3(1分子咖啡?；?，推測峰25、26為diCOA及其同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻[34,38-39]及保留時間等信息，推測峰25、26分別為3,9-diCOA、4,9-diCOA。

2.3.3三咖啡?？鼘幩犷惢衔镨b定 峰35～38(圖7a)的精確分子質(zhì)量為677.151 70，推測其元素組成為C34H29O15(質(zhì)量誤差分別為-0.75×10-6、0.43×10-6、1.46×10-6、-0.31×10-6)，在MS3中的碎片離子與峰19～22的MS2碎片基本一致。根據(jù)峰35～38的準分子離子與峰19～22的準分子離子相差C9H6O3(1分子咖啡酰基)，推測峰35～38為triCQA及其同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻[34,38-39]及保留時間等信息，推測峰35～38分別為1,3,5-triCQA、1,4,5-triCQA、1,3,4-triCQA、3,4,5-triCQA。

圖7 燈盞細辛中三咖啡酰酯類化合物的提取離子色譜圖Fig.7 Extracted ion chromatograms of tricaffeoyl esters compounds in Erigeron breviscapus

峰39(圖7b)的精確分子質(zhì)量為705.146 39，推測其元素組成為C35H29O16(質(zhì)量誤差-0.41×10-6)，在MS3中的碎片離子與峰24的MS2碎片基本一致。根據(jù)峰39的準分子離子與峰24的準分子離子相差C9H6O3(1分子咖啡酰基)，推測峰39為triCDOA。根據(jù)文獻[34,38]及保留時間等信息，推測峰39為3,4,9-triCDOA。

同理，鑒定峰40～44(圖7c)為triCOA及其同分異構(gòu)體。

2.4 燈盞細辛注射液中黃酮類化合物鑒定

在HESI負離子模式下，峰53的準分子離子峰為m/z301.035 11 [M-H]-，元素組成為C15H9O7(質(zhì)量誤差0.89×10-6)。在MS/MS中產(chǎn)生m/z273.04、257.04、229.05、179.00、151.00、107.01等碎片離子，示于圖8a，其中碎片離子m/z151.00、179.00是黃酮類化合物RDA1,3A-裂解產(chǎn)生的互補離子；m/z273.04、257.04為黃酮C環(huán)裂解分別丟失CO和O形成的碎片離子。根據(jù)文獻[46-47]，鑒定峰53為槲皮素，其質(zhì)譜裂解途徑示于圖8b。

圖8 槲皮素標準品的MS2譜圖(a)和碎裂途徑(b) Fig.8 MS2 spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of quercetin standard

在燈盞細辛提取液中還鑒定到峰山柰酚(峰45)、木犀草素(峰46)、芹菜素(峰47)、槲皮素-3-O-β-半乳糖醛酸苷(峰61)、野黃芩苷(峰62)、5,6,4′-三羥基黃酮-7-O-β-D-半乳糖醛酸苷(峰63)、芹菜素-7-O-β-半乳糖醛酸苷(峰64)、4′-羥基黃芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(峰57)、黃芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(峰59)、芹菜素-7-葡萄糖苷(峰60)等黃酮類化合物。

在燈盞細辛注射液中共鑒定到84種化學成分，其中49種成分為燈盞細辛制劑中首次鑒定，具體信息列于附表1(請登錄《質(zhì)譜學報》官網(wǎng)http:∥www.jcmss.com.cn下載)。

3 結(jié)論

本研究針對中藥注射液復(fù)雜的化學成分體系，采用簡單的前處理方法，同時結(jié)合超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜和分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，建立了一種快速篩查和鑒定中藥燈盞細辛注射液中化學成分的分析方法。該方法操作簡單、重現(xiàn)性好、分辨率高，可實現(xiàn)對燈盞細辛注射液中84種化學成分的快速篩查。本研究進一步豐富和細化了燈盞細辛有效成分信息特征，可為燈盞細辛化學成分的分析提供參考，對燈盞細辛注射液的進一步研究和安全使用具有重要意義。