郇昌翔 綜述，盧發(fā)強(qiáng)△ 審校

1.大連大學(xué)中山臨床學(xué)院，遼寧大連 116001；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，遼寧大連 116001

股骨頭壞死(ONFH)是一種由于股骨頭靜脈淤滯或動(dòng)脈供血受損或中斷而導(dǎo)致骨細(xì)胞和骨髓成分局部死亡，股骨頭結(jié)構(gòu)惡化和塌陷導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的疾病。根據(jù)致病因素可分為創(chuàng)傷性股骨頭壞死(TONFH)和非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(NONFH)[1]。前者病因確定，而后者主要病因可分為長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類(lèi)固醇激素、長(zhǎng)期大量飲酒、自身免疫性疾病和特發(fā)性疾病等，但是NONFH具體發(fā)病機(jī)制仍未有明確定論[2]。NONFH已經(jīng)變成世界性難題，在部分國(guó)家患病率逐年增長(zhǎng)[3]。目前，NONFH的診斷可依靠臨床特征和核磁共振、計(jì)算機(jī)斷層掃描等影像學(xué)技術(shù)，但早期NONFH患者的篩查仍存在局限性[1]。代謝組學(xué)作為臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新起的工程技術(shù)，能夠?qū)C(jī)體內(nèi)源性小分子代謝物的動(dòng)態(tài)變化和途徑做出判斷。因此，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)于尋找和探索NONFH的生物標(biāo)志物和發(fā)病機(jī)制有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。本文就近年來(lái)，代謝組學(xué)在NONFH的研究進(jìn)行綜述。

1 代謝組學(xué)應(yīng)用的合理性與流程

1.1代謝組學(xué) 代謝組學(xué)是通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)前后代謝物譜及其動(dòng)態(tài)變化來(lái)研究生物體系代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)[4]。代謝組學(xué)方法分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，前者應(yīng)用于新生物標(biāo)志物篩選和代謝通路的研究，而后者則用于相關(guān)功能代謝物的鑒定和定量[5-6]。

1.2代謝組學(xué)在NONFH應(yīng)用的合理性 現(xiàn)階段，NONFH的診斷主要依靠臨床特征與影像學(xué)診斷，但此時(shí)患者壞死區(qū)域已經(jīng)發(fā)生明顯的病理生理改變，臨床分期多位于股骨頭壞死國(guó)際分期(ARCO分期)Ⅲ～Ⅳ期，行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)為此期最佳治療方案[7]。這種方案創(chuàng)傷性較大且需要定期復(fù)查，因此在發(fā)病初期能夠確診NONFH，對(duì)于患者的治療和預(yù)后尤為重要。相對(duì)于基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝物和代謝通路變化可以系統(tǒng)地揭示機(jī)體生理病理狀態(tài)，依據(jù)生物信息學(xué)研究，探索疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，具有發(fā)現(xiàn)作用位點(diǎn)并進(jìn)行富集功能學(xué)驗(yàn)證等特點(diǎn)[8-9]。因此，代謝組學(xué)為NONFH的臨床研究提供了全新的探索方法，對(duì)患者的早期診斷和預(yù)后發(fā)展提供了精確的數(shù)據(jù)及理論支持。

1.3NONFH代謝組學(xué)操作流程 NONFH代謝組學(xué)操作流程大概分為樣品采集與預(yù)處理、分析技術(shù)選擇、數(shù)據(jù)處理、生物標(biāo)志物和代謝通路分析等。如圖1所示。

1.3.1樣品采集與預(yù)處理 在生物流體中，尿液是采集潔凈中段尿，同時(shí)加入諸如疊氮化鈉和氟化鈉等抑菌劑增加樣品穩(wěn)定性。血漿是血液在抗凝管中離心之后獲得的生物流體，在抗凝劑選擇中，肝素對(duì)不同官能團(tuán)的檢測(cè)效果最佳，是代謝組學(xué)研究的最佳血液標(biāo)本。標(biāo)本采集后應(yīng)當(dāng)在-80 ℃冰箱存儲(chǔ)且不可反復(fù)凍融[5]。

在樣品進(jìn)樣前，去除干擾雜質(zhì)(蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽)，將樣品以最適形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，以提高儀器檢測(cè)時(shí)的靈敏度和選擇性，稱(chēng)為預(yù)處理[10]。根據(jù)不同代謝物大概分為酸堿萃取、兩相萃取和冷熱有機(jī)溶劑萃取等方法[11]。

1.3.2分析技術(shù)選擇 樣品預(yù)處理完成后，需要選擇合適的分析技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，常采用聯(lián)用技術(shù)和多個(gè)方法進(jìn)行代謝組學(xué)研究。常用分析技術(shù)為核磁共振(NMR)以及質(zhì)譜(MS)與各種分離技術(shù)[氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)]。

1.3.3數(shù)據(jù)處理、診斷標(biāo)志物和代謝通路分析 數(shù)據(jù)預(yù)處理分為圖譜預(yù)處理(去噪平滑、基線校正)和數(shù)據(jù)預(yù)處理(峰識(shí)別、解卷積和濾噪等)[12]。為了對(duì)代謝組學(xué)中龐大、多維度的差異代謝物進(jìn)行判別分類(lèi)以及發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，分析過(guò)程中廣泛應(yīng)用模式識(shí)別技術(shù)，包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法使用主要成分分析，而有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法主要包括偏最小二乘法-判別分析[13]。經(jīng)過(guò)上述識(shí)別模式分析后，需要通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析軟件篩選出變量投影重要性(VIP)值，根據(jù)數(shù)值篩選出代謝物在研究組中的差異貢獻(xiàn)值。然后對(duì)篩選出的代謝物進(jìn)行Logistic回歸分析，建立受試者工作特征曲線和計(jì)算曲線下面積(AUC)，確定早期生物標(biāo)志物。

圖1 非創(chuàng)傷性股骨頭壞死代謝組學(xué)操作流程

2 代謝組學(xué)在NONFH中的研究

2.1NONFH臨床早期篩查生物標(biāo)志物 學(xué)術(shù)界目前對(duì)NONFH的診斷有著諸多限制因素。因?yàn)闆](méi)有發(fā)生引起疼痛的結(jié)構(gòu)變化，該病臨床癥狀并不明顯，因而患者可能錯(cuò)過(guò)早期篩查。中晚期髖骨關(guān)節(jié)炎、繼發(fā)于髖臼發(fā)育不良的骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎累及髖關(guān)節(jié)等疾病與早期NONFH患者在臨床癥狀、X線片或核磁共振表現(xiàn)相似，醫(yī)師若沒(méi)有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)則難以區(qū)分這些疾病[1,14]。核磁共振成像技術(shù)是對(duì)NONFH進(jìn)行非創(chuàng)傷性診斷的有效臨床適用方法，但對(duì)于早期疾病的診斷仍需要進(jìn)一步研究[15]。因此NONFH早期診斷成為學(xué)術(shù)界一重要難題。相對(duì)于基因組學(xué)仍需對(duì)基因表達(dá)下游進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，代謝組學(xué)技術(shù)則位于整個(gè)性狀表達(dá)的下游，是整個(gè)生物體系表達(dá)的最終結(jié)果，最適用于疾病生物標(biāo)志物和發(fā)病機(jī)制的研究。代謝組學(xué)中，經(jīng)過(guò)識(shí)別模式分析和多元統(tǒng)計(jì)分析后，常將VIP值大于1和AUC值大于0.85的指標(biāo)作為生物標(biāo)志物。現(xiàn)將所有文獻(xiàn)中關(guān)于NONFH早期生物標(biāo)志物歸入表1。

表1 NONFH早期生物標(biāo)志物

由表1可知，代謝組學(xué)在不同樣品采集與分析技術(shù)下對(duì)尋找生物標(biāo)志物有著不同的影響，究其原因大概分為3類(lèi)：樣品收集差異、分析技術(shù)差異、生物差異。血清與血漿差異主要在于是否存在凝血。血清是提供凝血過(guò)程中未去除的所有代謝物和蛋白質(zhì)的液體，而血漿需要加入肝素鋰和檸檬酸鹽等抗凝劑，其中檸檬酸鹽與某些代謝物具有相似分子量，對(duì)質(zhì)譜的測(cè)定會(huì)產(chǎn)生影響[6]。而尿液相對(duì)于血樣品更易受到環(huán)境因素的干擾。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與傳統(tǒng)高效液相色譜相比，使用了填充較小顆粒的短柱，代謝分析將具有更短的分析時(shí)間、更高的峰效率、更好的分辨率和更少的溶劑使用等優(yōu)點(diǎn)，靈敏度和特異度也將提升[21]。

從以上研究可知，目前NONFH早期診斷標(biāo)志物并無(wú)“金標(biāo)準(zhǔn)”，而代謝組學(xué)為標(biāo)志物的研究提出了探索性嘗試，后續(xù)可開(kāi)展前瞻性試驗(yàn)、隨機(jī)性人群隨訪試驗(yàn)對(duì)標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)表1可發(fā)現(xiàn)學(xué)術(shù)界并未有靶向代謝組學(xué)的相關(guān)研究，其原因是質(zhì)譜測(cè)定儀器和方法未能實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化，因此對(duì)高特異度和靈敏度標(biāo)志物的定量存在困難，需要繼續(xù)開(kāi)展后續(xù)研究彌補(bǔ)空白。

2.2NONFH代謝通路研究 在一項(xiàng)關(guān)于日本NONFH患者人群的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，51%的患者與類(lèi)固醇相關(guān)，31%的患者大量飲酒，3%的患者與類(lèi)固醇、飲酒均相關(guān)[22]。因此過(guò)量使用類(lèi)固醇或飲酒是NONFH的主要病因。類(lèi)固醇作用機(jī)制是氧化應(yīng)激可能損傷動(dòng)脈或小動(dòng)脈的血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加破骨細(xì)胞數(shù)量和活性，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，形成脂肪栓子和血液呈現(xiàn)高凝固低纖溶狀態(tài)，引起股骨頭內(nèi)缺血發(fā)作[23]。與皮質(zhì)類(lèi)固醇的作用相似，酒精可增加血管內(nèi)脂肪生成。代謝組學(xué)中，ZHU等[16]研究人員對(duì)比NONFH和頸骨骨折患者的骨組織，對(duì)差異性代謝物進(jìn)行分析，篩選出關(guān)鍵代謝途徑，如D-精氨酸和D-鳥(niǎo)氨酸等代謝通路。試驗(yàn)結(jié)果表明，NONFH臨近組織正處于壞死和正常之間。脂質(zhì)代謝紊亂主要發(fā)生在壞死期，推測(cè)在NONFH整個(gè)疾病過(guò)程中都發(fā)生了氨基酸代謝紊亂。選取股骨頭作為代謝輪廓的研究樣品，雖為最符合基礎(chǔ)研究的病理標(biāo)本，但是其將范圍限定于代謝通路在骨合成與骨代謝范圍內(nèi)，而機(jī)體是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的循環(huán)容器，類(lèi)固醇和酒精等因素最先通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用，因此需要更加全面的代謝分析。除此之外，其取材難度較大，創(chuàng)傷性高，不能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求。在此基礎(chǔ)之上，XU等[17]將22例NONFH患者和23例健康者的血清進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝和丙酮酸代謝與疾病的發(fā)生有著更相近的關(guān)系。YANG等[20]研究人員轉(zhuǎn)變思路，利用尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，對(duì)33個(gè)差異代謝物代入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析，結(jié)果表明硫代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘油磷脂代謝和組氨酸代謝可用于NONFH發(fā)病機(jī)制研究。

根據(jù)上述代謝組學(xué)研究結(jié)果可知，這或許與機(jī)體內(nèi)脂肪酸代謝相關(guān)。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也在開(kāi)展，康鵬德等[24]研究表明，在NONFH兔模型中體內(nèi)骨髓細(xì)胞脂肪變性、脂肪細(xì)胞直徑增大，體內(nèi)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞源性膜表面微粒數(shù)量增加，血液形成高凝易栓狀態(tài)。長(zhǎng)鏈飽和游離脂肪酸可以促進(jìn)血小板聚集，硬脂酸通過(guò)激活Ⅻ因子促使血小板聚集引起血液高凝[25]。血栓引起小血管局部循環(huán)栓塞，造成周?chē)鷦?dòng)靜脈供血困難，形成局部缺血性壞死。左旋肉堿是一種水溶性分子，長(zhǎng)鏈脂肪酸在線粒體β氧化中具有傳遞功能。在一項(xiàng)體外研究中，左旋肉堿可能會(huì)抵消過(guò)量的線粒體內(nèi)活性氧積累，而這種積累有利于衰老過(guò)程中成骨細(xì)胞代謝的改變[26]。

從以上研究可知，代謝組學(xué)可以明確反映NONFH潛在的代謝通路：脂類(lèi)代謝、核苷酸代謝和嘌呤代謝、能量代謝、氨基酸代謝等。現(xiàn)在將相關(guān)通路以圖式連接，以展示代謝組水平NONFH部分代謝通路。如圖2所示。

2.3NONFH治療及療效 臨床大劑量使用類(lèi)固醇后，患者3個(gè)月內(nèi)血液即可達(dá)到高凝狀態(tài)，血管內(nèi)皮炎癥加劇[27]。類(lèi)固醇激素誘發(fā)NONFH的一個(gè)潛在病因?yàn)榧に卣T導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生脂肪變形，成骨細(xì)胞分化障礙，靜脈血流減少[28]。他汀類(lèi)藥物一直是臨床使用的降血脂常用藥，有研究表明，雞模型中，每天給予20 mg洛伐他汀，實(shí)驗(yàn)組脂肪形成減少，無(wú)骨死亡[29]。體外研究顯示，培養(yǎng)骨髓細(xì)胞可抑制脂肪特異性基因的表達(dá)，對(duì)類(lèi)固醇抑制基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化產(chǎn)生拮抗作用[30]。REN等[31]利用UPLC-MS/MS測(cè)定了對(duì)照組、模型組和洛伐他汀藥物組兔血清后，兔血清中有11種磷脂酰膽堿代謝物發(fā)生顯著變化，主要涉及6種代謝途徑，病理切片表明脂肪細(xì)胞增殖減少，空骨陷窩率減少。這說(shuō)明洛伐他汀的作用機(jī)制可側(cè)面驗(yàn)證為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制脂肪生成，延緩骨細(xì)胞凋亡。

最新發(fā)布的《股骨頭壞死中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》中，將NONFH分為早、中、晚期，氣滯血瘀、痰瘀阻絡(luò)、經(jīng)脈痹阻、肝腎虧虛4型[32]?！疤叼鲎杞j(luò)”中“痰”血液循環(huán)的基礎(chǔ)是血液中脂質(zhì)變化與血液流態(tài)的改變[33]。中醫(yī)診療是為達(dá)到治療或輔助其他手段緩解關(guān)節(jié)疼痛，減小創(chuàng)傷，預(yù)防并發(fā)癥的目的。有研究采用大劑量激素誘導(dǎo)建立NONFH實(shí)驗(yàn)兔模型，基于超高效液相色譜分析技術(shù)顯示，在激素的作用下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體的血脂代謝出現(xiàn)顯著紊亂，而在骨蝕靈膠囊(中藥組)、洛伐他汀(西藥組)干預(yù)下，NONFH實(shí)驗(yàn)兔模型血脂代謝紊亂減緩，但中藥組調(diào)節(jié)效果強(qiáng)于西藥組；病理切片當(dāng)中，使用中藥后骨細(xì)胞恢復(fù)接近正常，而西藥組造血細(xì)胞仍在減少[34]。以上結(jié)果均說(shuō)明，提前提供藥物介入可有效糾正機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂和控制NONFH的發(fā)展，而使用骨蝕靈膠囊相對(duì)于服用洛伐他汀有較好的預(yù)防效果。隨后，該課題組進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，將血脂康膠囊、脂必妥片中藥制劑與辛伐他汀、苯扎貝特片西藥進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示中西藥在3、5周時(shí)各藥物干預(yù)組三酰甘油下降沒(méi)有顯著差異，但在電鏡檢查中，西藥組骨細(xì)胞體積小且染色體呈現(xiàn)塊狀，中藥療效高于西藥組。側(cè)面驗(yàn)證了中藥制劑有多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì)，對(duì)骨細(xì)胞生成和轉(zhuǎn)化有更顯著的保護(hù)作用。

從以上研究可知，代謝組學(xué)揭示了洛伐他汀和骨蝕靈膠囊等藥物對(duì)NONFH治療的示蹤軌跡，闡明了洛伐他汀在患者體內(nèi)的作用位點(diǎn)，證明早期NONFH的預(yù)防主要著重于降低血脂，預(yù)防病情進(jìn)一步發(fā)展，中藥制劑相較于西藥有著穩(wěn)定療效。但各種降血脂藥物預(yù)防NONFH的機(jī)制并不清楚，仍需要更多基礎(chǔ)研究和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究給予理論支持。

圖2 NONFH部分代謝通路

2.4NONFH分期研究 NONFH的預(yù)后與疾病分期有著密切關(guān)聯(lián)。在一項(xiàng)對(duì)早期NONFH患者進(jìn)行了平均隨訪時(shí)間為9年的隨訪研究中，以Harris評(píng)分<70分或手術(shù)為終點(diǎn)，1、2、5年和10年的累積生存率分別為60.0%、43.3%、38.9%和37.2%[35]。生存曲線表明，初始診斷后 90 個(gè)月可能會(huì)出現(xiàn)臨床惡化，這表明應(yīng)仔細(xì)跟蹤無(wú)癥狀患者數(shù)年，即使塌陷很小，但沒(méi)有進(jìn)行性塌陷的放射學(xué)時(shí)間依賴(lài)性縮小也可能代表修復(fù)。ARCO分期標(biāo)準(zhǔn)主要依賴(lài)影像手段，但有著篩查費(fèi)用高昂、臨床經(jīng)驗(yàn)不足和易與其他骨科疾病混淆的局限性。因此急需一項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)為判斷NONFH的進(jìn)展提供參考依據(jù)。有一項(xiàng)代謝組學(xué)研究將日本白兔NONFH進(jìn)程分為1～6期，在1～3期中對(duì)NONFH的代謝組學(xué)輪廓進(jìn)行研究，在隨后4～6期中對(duì)血清標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。研究者從1期開(kāi)始區(qū)分起始點(diǎn)的潛在代謝物。注射糖皮質(zhì)激素后，PC(36∶3)和LysoPC(16∶1)等8種含量低于起始點(diǎn)，PC(16∶1)和PC(40∶6)含量高于起始點(diǎn)。為了證明10種代謝產(chǎn)物與NONFH終點(diǎn)指標(biāo)是否相關(guān)，研究者進(jìn)行了第2項(xiàng)動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明10種代謝產(chǎn)物與發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)相同。他們采用隨機(jī)森林法構(gòu)建不同特征模型，同時(shí)建立了代謝物與NONFH預(yù)后模型，發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異度均達(dá)到了0.998，根據(jù)代謝物的變換可對(duì)NONFH進(jìn)程進(jìn)行提前預(yù)判[31]。

以上研究結(jié)果提示，代謝組學(xué)技術(shù)可依據(jù)靜脈抽血的方式，對(duì)術(shù)前NONFH進(jìn)程進(jìn)行預(yù)估，與影像檢查聯(lián)合使用后可提高早期NONFH的確診率，治療效果進(jìn)一步提高。

3 展 望

隨著生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，代謝組學(xué)的出現(xiàn)相對(duì)于其他組學(xué)技術(shù)，重新定義了對(duì)機(jī)體生物系統(tǒng)代謝物的綜合分析。代謝組學(xué)技術(shù)在NONFH研究領(lǐng)域取得了可視的進(jìn)步，在早期生物標(biāo)志物、代謝通路研究和藥物治療位點(diǎn)與療效監(jiān)測(cè)方面有著基石作用。在后續(xù)的科研中，筆者將對(duì)某基因進(jìn)行上下游敲除或酶抑制劑進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，對(duì)代謝物進(jìn)行體外細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，旨在研究NONFH發(fā)病機(jī)制的完整表達(dá)過(guò)程和治療靶點(diǎn)的探尋。代謝組學(xué)作為基礎(chǔ)領(lǐng)域研究，應(yīng)與臨床研究相互轉(zhuǎn)化，開(kāi)展更多對(duì)骨質(zhì)疏松、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良和頸骨骨折伴有高血脂和高凝血患者進(jìn)行多年隨訪的相關(guān)臨床研究。