余聞靜，葉航羊，嚴(yán)茹心，左錢飛，范俊杰，龍宇鵬△

1.陸軍第九五八醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400023；2.西藏軍區(qū)總醫(yī)院肝膽科，西藏拉薩 850000；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，重慶 400038；4.陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系微生物與生化教研室，重慶 400038

棘球蚴病又稱包蟲病，是一種重要的人畜共患寄生蟲病。棘球蚴病一般分為囊型棘球蚴病(CE)和泡型棘球蚴病(AE)，分別由細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲感染引起[1]。該病呈現(xiàn)世界性分布，每年感染率超過0.05%；在我國西部，該病的流行尤其嚴(yán)重，感染率可以達(dá)到5%～10%，是平均水平的100余倍。據(jù)保守估計(jì)，全球由于CE產(chǎn)生的最低傷殘調(diào)整壽命年(一種衡量人們健康受損的指標(biāo))約為28.5 萬年，每年可造成1.94億美元經(jīng)濟(jì)損失[2]，給公共健康和安全以及農(nóng)業(yè)發(fā)展造成巨大影響。

細(xì)粒棘球絳蟲的感染性較強(qiáng)，主要寄生于肝臟。根據(jù)WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將CE患者分為3級(jí)：感染期(C1、C2期)、過渡期(C3期)以及潛伏期(C4、C5期)[3-4]。目前，對(duì)于CE患者主要的治療策略為藥物治療(如阿苯達(dá)唑、苯并咪唑)，但仍有20%～40%的深度感染期患者并不能徹底治愈[5]，因此，早期的臨床診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。臨床上，CE的診斷一方面依靠影像學(xué)方法，如X線片、CT、MRI等[6-8]，另一方面依靠血清學(xué)檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。目前，建立血清學(xué)檢測(cè)方法的抗原一般采用的是包囊液粗提物，由于無法排除宿主本身的抗原蛋白，檢測(cè)結(jié)果往往出現(xiàn)假陽性[9-10]。Antigen 5(Ag5)是CE中免疫原性最強(qiáng)、富集程度最高的抗原之一，伴隨細(xì)粒棘球絳蟲整個(gè)生命周期[11]。本研究選取Ag5作為目標(biāo)抗原，建立間接ELISA(iELISA)法，通過檢測(cè)血清中Ag5抗體水平實(shí)現(xiàn)對(duì)CE患者高特異度和高靈敏度的臨床診斷。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2021年1月西藏軍區(qū)總醫(yī)院收治的184例肝CE患者，平均年齡(48±13)歲。采集所有患者血清，1 000 ×g離心后凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。同時(shí)，收集同期在陸軍第九五八醫(yī)院體檢的126例健康人血清作為陰性對(duì)照。本研究經(jīng)西藏軍區(qū)總醫(yī)院和陸軍第九五八醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)影像學(xué)手段(CT或MRI)明確診斷肝CE；(2)基本信息完整，臨床及影像資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)資料信息不完善;(2)具有對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾的其他疾病；(3)因某些情況不能配合檢查。

1.2主要試劑 大腸埃希菌DH5α及BL21(DE3)購自北京全式金生物科技有限公司；pGEX-6P-2 原核表達(dá)載體由陸軍第九五八醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司；高保真DNA聚合酶、DNA Marker、BamH Ⅰ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自大連TakaRa公司；PreScission protease(PSP酶)購自瑞士GE Healthcare公司;HRP標(biāo)記的小鼠抗人IgG(H+L)抗體購自美國Jackson Immuno-Research Laboratories;檢測(cè)棘球絳蟲IgG的商品化試劑盒購自德國R-Biopharm AG公司；進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)與純化 以細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA基因組為模板，通過構(gòu)建引物進(jìn)行PCR。上游引物：5′-GCGGGATCCATGGCGAGATCGCGGCCCCTTTGGATCGTTTTCGTCTGTC-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))； 下游引物：5′-GCGGCGGCCGCTTAGACTGCGTAGCGGTTGATCCACTGGATG ACACTGCCCAC-3′(下劃線為NotⅠ酶切位點(diǎn))。經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后將PCR產(chǎn)物及pGEX-6P-2質(zhì)粒進(jìn)行連接獲得pGEX-6P-2-Ag5。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL-1blue，挑取單克隆于30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至600 nm處吸光度(A)為0.6終止，加入100 μg/mL IPTG 于30 ℃誘導(dǎo)3 h。超聲裂解后高速離心15 min，分離上清液和沉淀；將Glutathione Sepharose 4B加入上清液中，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜。離心收集特異性結(jié)合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B，隨后加入等體積PBS和PSP酶(酶量體積比為1∶10)，于室溫進(jìn)行酶切，再次離心后吸取上清液，重懸于PBS中備用。

1.4iELISA方法的建立

1.4.1最佳包被濃度及反應(yīng)條件 將純化后的Ag5蛋白按200 ng/mL包被于96孔板后置于4 ℃過夜，次日用1× PBST(PBS含0.05%吐溫)洗滌，接著利用2%的牛血清清蛋白(BSA)在37 ℃ 封閉2 h；將待檢血清進(jìn)行1∶200稀釋后于37 ℃ 孵育1 h；孵育完成后，利用HRP標(biāo)記的抗人IgG二抗(1∶50 000稀釋)繼續(xù)孵育30 min；徹底洗滌后，加入TMB室溫顯色15 min；在450 nm條件下讀取并扣除背景A值即為樣品讀值。

1.4.2臨界值的確定 為了提高Ag5包被的iELISA法的靈敏度及特異度，選取29例健康人血清為陰性對(duì)照；陽性對(duì)照來自經(jīng)影像學(xué)及手術(shù)確診的34例CE患者。陽性和陰性對(duì)照的血清分別經(jīng)商品化棘球蚴病檢測(cè)試劑盒確認(rèn)。設(shè)置重復(fù)孔，檢測(cè)并讀取各血清標(biāo)本的A比值，經(jīng)受試者工作特征(ROC)曲線分析以確定最佳臨界值。利用(A待檢血清-A陰性對(duì)照)/(A陽性對(duì)照-A陰性對(duì)照)計(jì)算出A比值，A比值越高，表明Ag5抗體水平越高。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GrapPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料兩組間比較采用Wilcoxon檢驗(yàn),多組間比較采用Kruskal-WalisH檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Mann Whitney-U檢驗(yàn)；采用ROC曲線評(píng)估本研究建立的iELISA方法的診斷效能;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CE患者分型 經(jīng)CT、MRI影像學(xué)分析，約80%(152/184)的CE患者表現(xiàn)為肝臟單一病灶，另有部分CE患者(32/184)呈現(xiàn)不同器官或組織如肺臟、腎臟、皮下等的散發(fā)病灶。所有病例中，包囊過渡型CE患者(CE3a、CE3b)占比(52.7%)最高,活化型(CE1、CE2)及失活型(CE4、CE5)CE患者分別為19.6%和27.7%。見表1。

表1 CE患者的數(shù)量及分型[ n(%)]

2.2重組蛋白Ag5的構(gòu)建、表達(dá) 以細(xì)粒棘球絳蟲基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出目的條帶，片段大小為1 455 bp，與預(yù)期結(jié)果符合。融合表達(dá)載體pGEX-6P-2-Ag5構(gòu)建后經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序分析無誤后，轉(zhuǎn)入XL-1blue，獲得重組菌株。誘導(dǎo)表達(dá)獲得Ag5/GST重組融合蛋白，PSP酶酶切Ag5/GST重組融合蛋白，酶切后目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，如圖1所示，與預(yù)期目的蛋白分子量大小一致。

注：1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為重組表達(dá)蛋白。

2.3iELISA方法的建立及應(yīng)用

2.3.1臨界值的確定 利用Ag5包被的iELISA方法對(duì)陰性和陽性血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，ROC曲線分析顯示，曲線下面積(AUC)為0.972，當(dāng)臨界A比值為0.46時(shí)，iELISA方法具有最佳的靈敏度和特異度，其中靈敏度為91.6%，特異度為96.3%。見圖2。

圖2 iELISA方法診斷CE的ROC曲線

2.3.2CE患者及健康人Ag5抗體檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用本研究建立的iELISA方法對(duì)收集的CE患者及健康人血清的Ag5抗體進(jìn)行檢測(cè)。如圖3A所示，與健康人相比，CE患者血清中A比值明顯高于健康人(P<0.05)，表明CE患者血清中存在高水平的Ag5抗體。圖3B顯示，相對(duì)于CE1和CE2階段的患者，處于過渡期的CE3a及CE3b患者血清中具有較高水平的Ag5抗體(P<0.05)，而處于包囊無活性階段的CE4和CE5患者血清Ag5抗體水平較低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

采用本研究建立的iELISA方法及商品化棘球蚴病檢測(cè)試劑盒分別對(duì)CE患者及健康人Ag5抗體血清進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果顯示：iELISA方法及商品化試劑盒在CE1、CE2、CE3a、CE3b階段的CE患者檢測(cè)中表現(xiàn)出相近的陽性率，并且對(duì)于CE2、CE3b階段的CE患者，陽性率均在90%以上。對(duì)于CE4和CE5階段的患者，iELISA方法檢測(cè)的陽性率明顯高于商品化試劑盒(CE4:83.3%vs.70.8%，CE5:63.0%vs.48.1%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

注：A表示CE患者與健康人血清中Ag5抗體水平比較；B表示不同分型的CE患者血清中Ag5抗體水平比較；與健康人比較，#P<0.05； 與CE1、CE2比較，*P<0.05。

2.3.3不同臨床特征的CE患者檢測(cè)結(jié)果 按照包囊活性、包囊數(shù)量、是否接受藥物或手術(shù)治療等將患者分組，分別統(tǒng)計(jì)其樣本數(shù)量及陽性率。有活性包囊、多包囊、接受藥物治療的患者陽性率均高于無活性包囊、單包囊、未接受藥物治療的患者(91.7%vs. 72.5%,94.0%vs.84.8%,94.1%vs.72.3%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而手術(shù)治療患者的陽性率與未手術(shù)治療的患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 本研究建立的iELISA方法與商品化試劑盒檢測(cè)Ag5抗體結(jié)果的對(duì)比

表3 利用iELISA檢測(cè)不同CE患者的結(jié)果

3 討 論

CE是一種嚴(yán)重的人畜共患病，對(duì)公共健康及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。早期診斷可以幫助CE患者通過藥物治療及時(shí)清除感染。細(xì)粒棘球絳蟲感染后通常不表現(xiàn)出劇烈的癥狀，但機(jī)體會(huì)很快建立體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)。有證據(jù)表明，Th2細(xì)胞是介導(dǎo)抗細(xì)粒棘球絳蟲的重要T細(xì)胞亞群，其分泌的白細(xì)胞介素(IL)-4能夠參與特異性IgG1抗體的產(chǎn)生[12]；據(jù)報(bào)道，在感染細(xì)粒棘球絳蟲的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，IL-12協(xié)同γ-干擾素(IFN-γ)可以顯著上調(diào)特異性IgG2a抗體水平[13]，說明Th1細(xì)胞亞群在抗感染過程中也發(fā)揮一定的作用。

CE的臨床診斷可采用影像學(xué)方法，但該方法受限于技術(shù)操作等難以實(shí)現(xiàn)大范圍的篩查；而血清學(xué)方法能夠很好地彌補(bǔ)其不足，是檢測(cè)CE的重要手段。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(IHA)因?yàn)槿狈^高的靈敏度和特異度，逐漸被ELISA、間接免疫熒光(IFAT)、免疫電泳(IEP)等所取代[14]。除此之外，多種快速檢測(cè)CE的方法已被建立并報(bào)道：研究者利用特異性抗原包被的試紙，在短時(shí)間內(nèi)可完成對(duì)CE的診斷[15]；利用棘球絳蟲特異性表達(dá)的4種抗原建立的斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法(DIGFA)，能夠在極短時(shí)間內(nèi)顯示檢測(cè)結(jié)果[16]；另外，針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲線粒體基因，利用重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RAA)在不依賴PCR儀的情況下能夠快速進(jìn)行基因診斷[17]。在進(jìn)一步提高靈敏度和特異度之后，這些方法都具有診斷CE的臨床應(yīng)用潛力。

據(jù)調(diào)查，在CE流行的地區(qū)，約1/4的受檢者呈現(xiàn)包蟲囊液提取物抗體陽性，但是只有少部分CE患者被確診，說明血清中包蟲囊液抗體水平并不能特異性地作為檢測(cè)指標(biāo)[18]?？乖慕徊娣磻?yīng)限制了包囊液在CE臨床診斷中的價(jià)值[19]。目前，多種抗原已被鑒定并應(yīng)用于血清學(xué)檢測(cè)中，如AgB[16]、EpC1[20]、Eg19[21]、C317、E14t[22]等。與這些抗原不同的是，Ag5能夠在細(xì)粒棘球絳蟲感染的不同階段均表現(xiàn)出免疫原性[10]，根據(jù)這一特征，本研究選擇Ag5作為目標(biāo)抗原建立特異性檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲抗體的iELISA方法。

利用本研究建立的iELISA方法對(duì)184例CE患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與商品化試劑盒檢測(cè)方法相比，iELISA方法具有更低的假陽性率(2.4%vs. 4.8%)。此外，處于活性包囊以及多包囊階段的CE患者呈明顯的高陽性率，提示CE患者血清中特異性細(xì)粒棘球絳蟲抗體水平與包囊數(shù)量、活性狀態(tài)密切相關(guān)。另外，經(jīng)過藥物治療的CE患者也有較高的陽性率，推測(cè)可能是由于藥物導(dǎo)致包囊被破壞，抗原釋放至外周血中所致。因此，基于Ag5建立的iELISA方法不僅能夠用于CE的臨床診斷，對(duì)于評(píng)價(jià)藥物或手術(shù)治療的有效性同樣存在應(yīng)用價(jià)值。