周亞萍，李 翔，趙紅梅，王 芳，張?zhí)煲?，?娜，黃夢(mèng)君，伏建峰

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷中心，新疆烏魯木齊 830000；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師哈密紅星醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆哈密 839000；4.新疆軍區(qū)總醫(yī)院普外科，新疆烏魯木齊 830000；5.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院，新疆烏魯木齊 830000

根據(jù)WHO發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，全世界女性人群中新發(fā)甲狀腺癌達(dá)45萬(wàn)例[1]。國(guó)內(nèi)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2020年我國(guó)甲狀腺癌發(fā)病率高達(dá)8.49%，在女性人群新發(fā)腫瘤中位列第四，其中，乳頭狀癌占所有病理類型的85%[2]。目前，臨床上應(yīng)用最廣、準(zhǔn)確率最高的診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的方法是超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNAC)。通過(guò)術(shù)前FNAC，仍有約20%的甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)無(wú)法確定，加上患者對(duì)于侵入性的有創(chuàng)檢查方法接受度普遍較低。因此，傳統(tǒng)的診斷方法有明顯的限制，制約著甲狀腺癌的臨床診斷效能。有研究表明，外泌體miRNA可作為多種腫瘤早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)及預(yù)后分析的生物標(biāo)志物，如乳腺癌、胃癌、膀胱癌等[3-5]。近期有文獻(xiàn)報(bào)道，外泌體miRNA在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者血清、血漿中的表達(dá)水平可發(fā)生顯著性變化，提示其可能是PTC診療過(guò)程中潛在的理想生物標(biāo)志物[6-7]。基于以上認(rèn)知和PTC的臨床診斷現(xiàn)狀，本研究依托高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息分析平臺(tái)，全面分析PTC患者血清外泌體miRNA圖譜，以期獲得有利于PTC診斷的外泌體miRNA生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月1日至3月31日新疆軍區(qū)總醫(yī)院普外科收治的PTC患者6例(年齡29～40歲，中位年齡33歲)作為PTC組，選取體檢健康者6例(年齡26～35歲，中位年齡29歲)作為對(duì)照組。入組的PTC患者均經(jīng)過(guò)病理活檢確認(rèn)，并且在標(biāo)本采集前均未進(jìn)行手術(shù)治療、放療、化療和藥物治療。對(duì)照組按照PTC組患者的性別、年齡1∶1匹配，均未患有其他甲狀腺疾病及惡性腫瘤，甲狀腺功能無(wú)明顯異常。本研究通過(guò)新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，入組研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 超速離心機(jī)CP80WX購(gòu)自日本Himac公司；低速離心機(jī)TDZ5-WS購(gòu)自湖南湘儀有限公司；超低溫冰箱Forma 900 series購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；透射電子顯微鏡G2 spititi購(gòu)自美國(guó)FEI公司；納米粒度電位儀Zetasizer Ultra購(gòu)自英國(guó)Malvern公司；垂直電泳槽-1658004購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Agilent 2200 TapeStation系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；測(cè)序平臺(tái)HiSeq 2500購(gòu)自美國(guó)Illumina公司；普通碳支持膜BZ11022A購(gòu)自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；miRNA分離提取試劑盒R4163購(gòu)自廣州Magen生物公司；CD63抗體、TSG101抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理 無(wú)添加劑的外周全血標(biāo)本采集后10 min內(nèi)移至4 ℃冰箱靜置3～4 h；20 ℃ 2 000×g離心10 min，收集淡黃色上清液，然后4 ℃ 10 000×g離心10 min，盡可能清除細(xì)胞碎片，保證血清的質(zhì)量。將血清按照500 μL每管分裝至EP管，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.2血清外泌體提取 按照金標(biāo)準(zhǔn)差速超高速離心法從血清中提取純化外泌體囊泡：于超凈工作臺(tái)中取2 mL血清和10 mL PBS溶液至15 mL離心管，4 ℃ 300×g離心10 min，上層上清液轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管；然后4 ℃2 000×g離心10 min，收集上清液于10 mL離心管，4 ℃ 12 000×g離心30 min，吸取上清液至新的10 mL離心管；4 ℃ 120 000×g離心70 min，收獲下層透明沉淀，并用100 μL PBS溶液進(jìn)行重懸，將收獲的外泌體置于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.3.3血清外泌體鑒定

1.3.3.1透射電子顯微鏡法 將收獲的血清外泌體取出后置于冰盒上，吸取15 μL外泌體于銅網(wǎng)上靜置60 s，用濾紙吸干多余的液體，然后加入15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色液，室溫下染色1 min，再用濾紙反復(fù)吸去多余液體，將負(fù)染后的外泌體置于燈下烤10 min，最后通過(guò)電鏡觀察囊泡并拍照。

1.3.3.2外泌體粒徑分析 將提取的血清外泌體稀釋于1 mL PBS溶液中，將其緩慢注入樣品池，通過(guò)納米粒度電位儀對(duì)外泌體的納米粒子進(jìn)行跟蹤分析，計(jì)算外泌體的顆粒濃度和尺寸分布曲線。

1.3.3.3蛋白印跡分析 通過(guò)添加苯甲基磺酰氟(PMSF)及蛋白酶抑制劑(Cocktail)的放射免疫沉淀分析(RIPA)方法提取總蛋白，之后行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，切除濃縮膠后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜?？笴D63、抗TSG101抗體和二抗用封閉液按比例稀釋，NC膜與稀釋抗體室溫條件下孵育60 min；然后將超靈敏ECL發(fā)光液和穩(wěn)定液按1∶1體積混合，滴加到NC膜上，最后在凝膠成像系統(tǒng)上曝光拍照。

1.3.4RNA提取 根據(jù)miRNA分離提取試劑盒的說(shuō)明書從外泌體標(biāo)本中提取總RNA，將收獲的RNA樣品分裝至EP管，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5文庫(kù)制備和RNA測(cè)序 用8 μL的RNA樣品建立RNA測(cè)序文庫(kù)。向提取的RNA片段樣品加入3′接頭、反轉(zhuǎn)錄引物和5′接頭，反轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)單鏈cDNA，之后行PCR反應(yīng)，以豐富目標(biāo)基因片段；通過(guò)Qubit 熒光計(jì)定量?jī)x和Agilent 2200 TapeStation系統(tǒng)，對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量控制；質(zhì)檢合格的樣品上機(jī)HiSeq測(cè)序儀，完成全基因組測(cè)序過(guò)程。

1.3.6生物信息學(xué)分析 通過(guò)DESeq2軟件行生物信息分析，首先對(duì)上機(jī)得到的初始數(shù)據(jù)過(guò)濾篩選：去除讀數(shù)兩端的接頭、片段長(zhǎng)度<17 nt的讀數(shù)等，以獲取高質(zhì)量的潔凈數(shù)據(jù)；然后將潔凈數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)而獲取全基因組讀數(shù)分布圖譜，對(duì)潔凈數(shù)據(jù)進(jìn)行ncRNA分類注釋。以P<0.05且表達(dá)倍數(shù)|log2(FoldChange)|>1為差異表達(dá)顯著界定標(biāo)準(zhǔn)，分析miRNA的特征并計(jì)算其具體的表達(dá)量[5-6]。最后預(yù)測(cè)差異顯著miRNA的靶基因，并對(duì)目標(biāo)基因行基因功能GO分析和KEGG分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過(guò)R語(yǔ)言軟件包對(duì)血清標(biāo)本中的差異表達(dá)外泌體miRNA進(jìn)行特征分析和表達(dá)量計(jì)算，采用泊松分布、Fisher精確檢驗(yàn)、似然比檢驗(yàn)鑒定差異表達(dá)的miRNA。

2 結(jié) 果

2.1血清外泌體分離和鑒定 采用粒徑分析儀、透射電子顯微鏡和蛋白印跡技術(shù)鑒定獲得的血清外泌體，以確保所提取外泌體的質(zhì)量：粒徑分析結(jié)果顯示，研究體系的粒子分散程度適宜，追蹤結(jié)果可信，PTC組和對(duì)照組樣品顆粒的峰面積占比分別為 97.9%、98.0%，粒徑主峰分別為114.8 nm和112.0 nm，見圖1；外泌體負(fù)染后經(jīng)透射電鏡觀察，粒徑20～200 nm外泌體顯示典型雙層膜結(jié)構(gòu)，見圖2；蛋白印跡試驗(yàn)進(jìn)一步確證外泌體的生物標(biāo)記物，PTC組和對(duì)照組血清外泌體均具有顯著可檢測(cè)的CD63和TSG101，見圖3。

注：A為PTC組外泌體粒徑分析；B為對(duì)照組外泌體粒徑分析。

注：白色實(shí)線為200 nm刻度條。

注：1～3為PTC組，4～6為對(duì)照組。

2.2RNA測(cè)序數(shù)據(jù)特征 結(jié)果顯示，血清外泌體標(biāo)本中共產(chǎn)生約8.88千萬(wàn)個(gè)原始測(cè)序讀數(shù)，去掉原始數(shù)據(jù)中多余的接頭序列、含有過(guò)多低質(zhì)量堿基和污染部分，得到約7.99千萬(wàn)個(gè)潔凈讀數(shù)用于進(jìn)一步分析。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制分析顯示，Q20的平均值為97.01%，Q30的平均值為94.00%，GC百分比平均值為52.66%。進(jìn)而將質(zhì)控分析后的潔凈讀數(shù)與miRNA/rRNA/tRNA/snRNA/snoRNA權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，結(jié)果表明miRNA約占20.02%，其他類型RNA約占79.98%。

2.3血清外泌體miRNA的表達(dá)特征 經(jīng)RNA鑒定、測(cè)序數(shù)據(jù)特征分析，共獲得795個(gè)miRNA，依托DEGSeq軟件完善miRNA生物信息特征分析，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量。結(jié)果顯示，以對(duì)照組為參照，共有47個(gè)外泌體miRNA在PTC組血清的表達(dá)中呈現(xiàn)出明顯差異(P<0.05)，其差異表達(dá)倍數(shù)|log2(FoldChange)|>1且P<0.05，30個(gè)miRNA表達(dá)顯著上調(diào)，17個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。其中15個(gè)miRNA差異表達(dá)倍數(shù)|log2(FoldChange)|>2且P<0.05：miRNA-1289、miRNA-519b-5p、miRNA-519a-5p、miRNA-522-5p、miRNA-518e-5p、miRNA-519c-5p、miRNA-523-5p、miRNA-124-3p、miRNA-6729-5p、miRNA-487a-5p在PTC患者血清外泌體中表達(dá)顯著上調(diào)；而miRNA-122-3p、miRNA-4669、miRNA-3680-3p、miRNA-455-3p、miRNA-3179在PTC患者血清外泌體中表達(dá)則顯著下調(diào)，有可能是PTC診斷的生物標(biāo)志物。

2.4差異miRNA的靶基因 采用TargetScan、miRDB、miRarBase、miRwalk 4款軟件分析預(yù)測(cè)差異外泌體miRNA(|log2(FoldChange)|>1且P<0.05)的靶基因。結(jié)果顯示，靶基因數(shù)目范圍為20～1 643，中位數(shù)為415。進(jìn)一步對(duì)差異顯著的外泌體miRNA目標(biāo)基因行KEGG分析，以期了解其具體的生物學(xué)作用。結(jié)果表明，所預(yù)測(cè)的目標(biāo)基因被聚集于30條信號(hào)路徑中，其中MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和PI3K/Akt 信號(hào)通路等多條通路與惡性腫瘤關(guān)系密切。

采用GO功能注釋，為候選靶基因提供功能注釋，以認(rèn)識(shí)候選靶基因的潛在生物性能。結(jié)果顯示，差異外泌體miRNA的靶基因富集于細(xì)胞形態(tài)和代謝調(diào)控、生物合成調(diào)控、蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。依據(jù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，繪制了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示miRNA-511-5p、miRNA-543、miRNA-1290、miRNA-16-2-3p、miRNA-193b-5p、miRNA-625-3p、miRNA-455-5p、miRNA-654-3p、miRNA-4669的靶基因可以通過(guò)共同基因相互連接，靶基因富集的信號(hào)通路相互串聯(lián)，以達(dá)到傳遞生物信號(hào)、調(diào)節(jié)生理生化過(guò)程等目的，也可能是PTC重要的致病機(jī)制。

3 討 論

理想的腫瘤生物標(biāo)記物應(yīng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便獲取、創(chuàng)傷性小，患者接受度高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)《甲狀腺癌診療規(guī)范(2018年版)》，癌胚抗原(CEA)、甲狀腺球蛋白(Tg)診斷甲狀腺癌時(shí)特異度較低，臨床上一般用于甲狀腺腫瘤切除術(shù)后的病情監(jiān)測(cè)和甲狀腺髓樣癌的治療效果評(píng)價(jià)[8]。目前，臨床診療過(guò)程中尚無(wú)明確的能用于PTC診斷的特異性生物標(biāo)記物。游離DNA用于多種疾病診斷是近年來(lái)體液活檢研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其可準(zhǔn)確評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的突變狀態(tài)，但是該方法不適用于PTC，因?yàn)镻TC患者的游離DNA突變率和檢出率都極低[9]。此外，循環(huán)體液中的RNA分子性質(zhì)不穩(wěn)定，容易被核酸酶水解，限制了游離RNA分子作為腫瘤生物標(biāo)記物的應(yīng)用[10]?；谝陨吓R床應(yīng)用和研究現(xiàn)狀，無(wú)創(chuàng)、有效、可控的生物標(biāo)志物應(yīng)用于甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷和鑒別診斷一直是臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。

高通量測(cè)序是目前常用的一種篩選方法，與基于聚合酶鏈反應(yīng)的分析方法或基于雜交原理的檢測(cè)方法相比具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。首先，二代測(cè)序技術(shù)可以識(shí)別外泌體囊泡中低豐度的miRNA，進(jìn)而提供一個(gè)更加完整的外泌體miRNA表達(dá)圖譜。其次，高通量測(cè)序技術(shù)可以快速、高效、全方位地分析外泌體miRNA表達(dá)水平，加之其可以獨(dú)立于目前已有的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，從而利于識(shí)別既往未發(fā)現(xiàn)的miRNA。

外泌體囊泡具有細(xì)胞類型特異性、穩(wěn)定性、可獲得性等特點(diǎn)[11]。囊泡獨(dú)特的雙層膜結(jié)構(gòu)，對(duì)其運(yùn)載物質(zhì)發(fā)揮持續(xù)保護(hù)作用，其衍生的miRNA以高度穩(wěn)定的形式在體液中循環(huán)，目前有研究分析了膀胱癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌的外泌體miRNA表達(dá)譜，但PTC血清外泌體miRNA的文獻(xiàn)報(bào)道較少。PAN等[6]通過(guò)二代測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一組以miRNA-5189-3p為代表的差異表達(dá)miRNA，可能是判斷甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的候選標(biāo)志物。同時(shí)有研究表明，miRNA-21在PTC患者血漿外泌體中過(guò)度表達(dá)，有助于PTC和濾泡性甲狀腺癌的鑒別[12]。此外，有學(xué)者證實(shí)，與正常甲狀腺濾泡細(xì)胞相比，PTC細(xì)胞衍生的外泌體富含miRNA-146b和miRNA-222，可用于PTC的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)[13]。上述研究表明，PTC與外泌體miRNA的相關(guān)研究尚處于初期階段，研究的層次、深度和力度有待進(jìn)一步加深。因此，本研究基于外泌體內(nèi)容物miRNA開展，以期獲得新型PTC診斷生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，PTC組的外泌體miRNA具有獨(dú)特的表達(dá)特點(diǎn)，據(jù)此拓展研究的深度和層次，尋求可用于PTC診斷的分子標(biāo)記。研究中篩選到的多個(gè)差異表達(dá)外泌體miRNA與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，如miRNA-124-3p、miRNA-455-3p、miRNA-625-3p、let-7b-3p等。有學(xué)者通過(guò)miRNA芯片方法證實(shí)，血清中表達(dá)明顯上調(diào)的miRNA-124-3p可能是PTC診斷的候選標(biāo)志物[14]。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明miRNA-625-3p通過(guò)增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞基因1(AEG-1)表達(dá)，靶向激活下游的JNK信號(hào)路徑，從而促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生、增殖、遷移和侵襲[15]。本研究結(jié)果與既往研究取得了較好的一致性，對(duì)篩查有助于PTC診斷的外泌體miRNA奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

本研究還獲得了一些新的PTC相關(guān)差異表達(dá)miRNA，如miRNA-1290、miRNA-323a-3p、miRNA-543等，雖然未見這些miRNA與PTC關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)，但是在其他疾病中時(shí)有報(bào)道。如外泌體miRNA-1290可介導(dǎo)NKD1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[16]。miRNA-323a-3p可調(diào)節(jié)靶基因UHMK1表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[17]。因此，這些miRNA在PTC中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步探索。

腫瘤細(xì)胞源性的外泌體miRNA可以在細(xì)胞間穿梭，以達(dá)到信息交流和遺傳物質(zhì)交換的目的。外泌體攜帶運(yùn)輸?shù)膍iRNA還可以運(yùn)輸至遠(yuǎn)處器官、組織，從而參與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。因此，外泌體miRNA可根據(jù)其不同的靶基因發(fā)揮癌基因致癌或者抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNA靶基因富集的多條信號(hào)途徑與惡性腫瘤聯(lián)系緊密，其中包括經(jīng)典的MAPK信號(hào)路徑，該信號(hào)通路通過(guò)一系列蛋白激酶將生物信號(hào)有效傳遞至細(xì)胞核，控制細(xì)胞生長(zhǎng)周期、分化、炎癥等基本生理生化過(guò)程，是甲狀腺腫瘤發(fā)生的重要激活通路[18]。而差異miRNA靶基因富集的PI3K/Akt通路則可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的存活狀態(tài)和增殖進(jìn)程，在癌細(xì)胞發(fā)生黏附、遷徙、毛細(xì)血管生成等過(guò)程發(fā)揮至關(guān)重要的作用[19]。因此，外泌體miRNA涉及的多種信號(hào)通路之間存在相互連接作用，為PTC靶向精確治療提供了新的方向。

受限于多方面因素的制約，本研究具有一定局限性。雖然在血清外泌體中發(fā)現(xiàn)了一組具有PTC診斷應(yīng)用前景的miRNA，但是尚未在更大的隊(duì)列分析中做進(jìn)一步的研究。在下一步的工作中，本課題組將在更大的隊(duì)列樣本中對(duì)候選的差異miRNA進(jìn)行PTC診斷效能評(píng)估。此外，外泌體miRNA的表達(dá)豐度是否受腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，也將是隨后研究的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。

綜上所述，本研究檢測(cè)、分析了PTC患者和健康對(duì)照者間的血清外泌體miRNA表達(dá)特征，經(jīng)篩選獲得了一組有利于PTC診斷的潛在血清生物標(biāo)志物，可為新型PTC診斷生物標(biāo)志物的獲取提供參考和借鑒。