張麗武 覃 緯 王 麗

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院產(chǎn)科,桂林市 541002，電子郵箱：923567063@qq.com)

下肢深靜脈血栓(lower extremity deep venous thrombosis，LEDVT)形成是剖宮產(chǎn)術(shù)后的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致妊娠死亡的常見(jiàn)原因之一[1-2]。雖然LEDVT發(fā)病率不高(每100名產(chǎn)婦約發(fā)生1～2例)，但由于LEDVT可引起產(chǎn)婦慢性疼痛、潰瘍、靜脈功能不全，嚴(yán)重影響產(chǎn)婦的生活質(zhì)量，因此越來(lái)越受到婦產(chǎn)科醫(yī)師的重視。研究表明，妊娠期發(fā)生LEDVT的風(fēng)險(xiǎn)是非妊娠期的4～6倍，妊娠3個(gè)月后LEDVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)開(kāi)始升高，隨著妊娠進(jìn)展LEDVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高，剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到最高，這提示妊娠過(guò)程造成的體內(nèi)微環(huán)境變化是導(dǎo)致LEDVT發(fā)生的重要原因[3]。有研究表明，抗血栓藥物可有效地降低剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的形成[4-5]，但在產(chǎn)科中使用抗血栓藥物具有嚴(yán)格的限制。因此，臨床上迫切需要一種更常規(guī)、更簡(jiǎn)便的治療策略以預(yù)防剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的發(fā)生。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)空氣波壓力治療儀可用于治療各種原因引起的LEDVT，其機(jī)制可能與加快下肢靜脈血流速度、上調(diào)內(nèi)源性纖溶因子水平、減少血流瘀滯有關(guān)[6]。本研究探討術(shù)中急性等容稀釋(acute normovolemic hemodilution，ANH)自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療對(duì)剖宮產(chǎn)術(shù)后產(chǎn)婦LEDVT形成的影響，并分析其與機(jī)體CD40/CD40配體(CD40 ligand,CD40L)系統(tǒng)、血漿D-二聚體、高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)水平之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月至2018年2月在我院行剖宮產(chǎn)術(shù)的300例產(chǎn)婦。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合剖宮產(chǎn)手術(shù)指征，均為單胎妊娠，產(chǎn)次、年齡不限，對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性下肢深靜脈瓣膜功能不全者，術(shù)前曾使用抗凝藥物治療及患有凝血功能障礙者，合并嚴(yán)重心、肝、腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病者。采用隨機(jī)數(shù)字表法將300例產(chǎn)婦分為對(duì)照組、稀釋組和聯(lián)合治療組，每組100例。3組產(chǎn)婦年齡、孕周、產(chǎn)前血紅蛋白、產(chǎn)前血細(xì)胞比容等一般資料的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。本研究嚴(yán)格遵照醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的基本原則，并經(jīng)廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

表1 3組產(chǎn)婦一般資料的比較(x±s)

1.2 治療方案 3組產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)術(shù)后均常規(guī)使用壓力襪預(yù)防LEDVT形成，對(duì)照組產(chǎn)婦術(shù)中采用貯存式自體輸血，稀釋組和聯(lián)合治療組產(chǎn)婦術(shù)中均采用ANH自體輸血，聯(lián)合治療組在術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始使用空氣波壓力治療儀治療。

貯存式自體輸血：貯存式自體輸血的采血過(guò)程與異體獻(xiàn)血過(guò)程相似，一般在術(shù)前3天完成，按總血量的10%～15%采集自體血1次，約200～400 mL，完成采集后妥善儲(chǔ)存；常規(guī)完成剖宮產(chǎn)手術(shù)，在血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定(血細(xì)胞比容<24%或血紅蛋白<80 g/L)時(shí)、失血量>300 mL時(shí)或手術(shù)主要步驟結(jié)束后回輸全部貯存的自體血。

ANH自體輸血：剖宮產(chǎn)手術(shù)開(kāi)始前，采集產(chǎn)婦自體血300～400 mL，儲(chǔ)存于500 mL的儲(chǔ)血袋內(nèi)，同時(shí)經(jīng)另一條靜脈輸注等量(300～400 mL)6%膠體液萬(wàn)汶(6%羥乙基淀粉130/0.4；德國(guó)費(fèi)森尤斯卡比股份有限公司，批號(hào)：81ML707)；常規(guī)完成剖宮產(chǎn)手術(shù)，在血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定(血細(xì)胞比容<24%或血紅蛋白<80 g/L)時(shí)、失血量>300 mL時(shí)或手術(shù)主要步驟結(jié)束后回輸全部自體血。

空氣波壓力治療：幫助產(chǎn)婦雙下肢穿戴好空氣波壓力治療儀(深圳原位醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：PCD-51)套筒，將套筒連接至主機(jī)，設(shè)備接通電源，將空氣波壓力治療儀的壓力設(shè)置為40 mmHg(5.33 kPa)?？諝獠▔毫χ委?0 mim/次，2次/d，連續(xù)治療3～5 d。

1.3 LEDVT診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有產(chǎn)婦于術(shù)后2周進(jìn)行LEDVT診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的LEDVT相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]：有下肢疼痛、腫脹、軟組織張力突然增高等臨床表現(xiàn)，活動(dòng)后癥狀逐漸加重，將患肢抬高可以緩解癥狀，在靜脈血栓發(fā)生部位常伴有壓痛，Neuhof征、Homans征陽(yáng)性；多普勒超聲檢查提示患肢血管血流呈現(xiàn)出不完全或者消失的影像；X線靜脈造影觀察髂靜脈有充盈缺損和側(cè)支形成，有雙軌癥及盆腔內(nèi)有側(cè)支開(kāi)放，以及靜脈內(nèi)部血流的缺損情況等。

1.4 觀察指標(biāo) (1)分別于手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第3天采集產(chǎn)婦空腹靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，3 000 r/min離心10 min后收集血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿中D-二聚體(試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：E-EL-H6145)、hs-CRP(試劑盒購(gòu)自美國(guó)博士德生物工程有限公司，批號(hào)：EK7040)及可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand,sCD40L)(試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：xy-E10109)的水平。(2)分別于手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第3天采集產(chǎn)婦空腹靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用5 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)等倍稀釋后置于含5 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心30 min，吸取白膜層，置于另一15 mL離心管中，加入2～3倍體積的無(wú)菌PBS，上下顛倒混勻，2 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗滌沉淀兩次，將所得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)置于無(wú)酶無(wú)菌1.5 mL EP管中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)PBMC中的CD40相對(duì)表達(dá)水平：提取PBMC中的蛋白并測(cè)定濃度，98℃變性5 min，冰上冷卻10 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后使用半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h。CD40一抗(Proteintech生物科技有限公司，批號(hào)：28158-1-AP)1∶600稀釋后4℃孵育16～18 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；1∶3 000稀釋二抗(Proteintech生物科技有限公司，批號(hào)：PR30009)后室溫(20℃～25℃)孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加入高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑顯影，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；Proteintech生物科技有限公司，批號(hào)：60004-1-Ig)基因?yàn)閮?nèi)參，采用灰度掃描法對(duì)CD40相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT發(fā)生率的比較 對(duì)照組、稀釋組及聯(lián)合治療組產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的發(fā)生率分別為9.0%(9/100)、2.0%(2/100)、1.0%(1/100)，3組產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.896，P=0.007)，其中聯(lián)合治療組的LEDVT發(fā)生率低于對(duì)照組(均P<0.05)，而稀釋組和聯(lián)合治療組的LEDVT發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 3組產(chǎn)婦手術(shù)前后血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平的比較 3組產(chǎn)婦手術(shù)當(dāng)天血漿中D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；術(shù)后第3天，3組產(chǎn)婦血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平由高到低均為對(duì)照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且聯(lián)合治療組產(chǎn)婦血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平，以及稀釋組產(chǎn)婦的血漿D-二聚體、sCD40L水平均低于手術(shù)當(dāng)天，對(duì)照組產(chǎn)婦血漿hs-CRP及sCD40L水平均高于手術(shù)當(dāng)天(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組產(chǎn)婦手術(shù)前后血漿D-二聚體、hs-CRP及sCD40L水平的比較(x±s)

2.3 3組產(chǎn)婦手術(shù)前后CD40相對(duì)表達(dá)水平的比較 手術(shù)當(dāng)天，3組產(chǎn)婦外周血PBMC的CD40相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后第3天，3組產(chǎn)婦外周血PBMC的CD40相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD40相對(duì)表達(dá)水平由高到低為對(duì)照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且稀釋組與聯(lián)合治療組外周血PBMC的CD40相對(duì)表達(dá)水平均低于手術(shù)當(dāng)天(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 3組產(chǎn)婦PBMC中CD40相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖1 3組產(chǎn)婦手術(shù)前后外周血PBMC中CD40的表達(dá)情況

3 討 論

LEDVT形成是導(dǎo)致產(chǎn)婦死亡的重要原因，因此，部分醫(yī)院對(duì)高危產(chǎn)婦采取抗血栓治療。在英國(guó)和日本的醫(yī)院，所有剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦均要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的LEDVT風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并強(qiáng)烈推薦使用低分子肝素鈉；而在美國(guó)的醫(yī)院，空氣波壓力治療則廣泛應(yīng)用于預(yù)防剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的形成[8-9]。本研究觀察ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療對(duì)剖宮產(chǎn)術(shù)后產(chǎn)婦LEDVT形成的影響。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組剖宮產(chǎn)術(shù)后的LEDVT發(fā)生率均低于對(duì)照組(均P<0.05)，這提示ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可有效地降低剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的發(fā)生率。ANH自體輸血通過(guò)采血后擴(kuò)容對(duì)血液具有一定的稀釋作用，稀釋后的血液具有黏稠度低、機(jī)體組織攝氧量高等優(yōu)點(diǎn)，可預(yù)防剖宮產(chǎn)術(shù)后LEDVT的形成；空氣壓力波治療儀通過(guò)氣囊從腳尖至大腿根部序貫進(jìn)行反復(fù)充氣與放氣，加快下肢深靜脈血液回流速度，改善局部微循環(huán)，從而起到預(yù)防LEDVT形成的作用。本研究中稀釋組和聯(lián)合治療組剖宮產(chǎn)術(shù)后的LEDVT發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與稀釋組產(chǎn)婦術(shù)后遵醫(yī)囑盡早床上活動(dòng)、家屬協(xié)助肢體按摩及盡早下床活動(dòng)有關(guān)。

血漿D-二聚體是一種反映機(jī)體纖溶活性的特異性降解產(chǎn)物，可反映機(jī)體的凝血狀態(tài)；hs-CRP是一種重要的炎癥標(biāo)記物，檢測(cè)其濃度對(duì)炎癥疾病的干預(yù)及預(yù)后具有指示作用[10-11]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第3天，3組產(chǎn)婦血漿D-二聚體及hs-CRP水平由高到低均為對(duì)照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且聯(lián)合治療組患者的血漿D-二聚體、hs-CRP水平，以及稀釋組的血漿D-二聚體水平均低于手術(shù)當(dāng)天，而對(duì)照組的血漿hs-CRP水平高于手術(shù)當(dāng)天(均P<0.05)。這表明ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可以影響機(jī)體的凝血功能和炎癥狀態(tài)，明顯降低產(chǎn)婦血漿的D-二聚體及hs-CRP水平，稀釋血液可以減少循環(huán)中的兒茶酚胺、皮質(zhì)醇濃度，有利于減輕炎癥應(yīng)激反應(yīng)程度。

CD40屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種Ⅰ型膜蛋白，以三聚體的形式表達(dá)于各種細(xì)胞的膜表面，編碼基因位于第20號(hào)染色體上。CD40的配體CD40L同樣表達(dá)于多種細(xì)胞，并且在體內(nèi)微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)被激活并由細(xì)胞膜表面分泌入血，并與細(xì)胞膜表面的CD40結(jié)合，激活包括核轉(zhuǎn)錄因子κB在內(nèi)的多條下游信號(hào)通路，最終導(dǎo)致促凝、促炎等關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，部分ST段抬高的心肌缺血患者采用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈穿刺治療后，局部循環(huán)呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，采用依諾肝素預(yù)防治療可有效地降低血栓事件的發(fā)生率同時(shí)伴有sCD40L水平的明顯下調(diào)[14]。在未去除CD40及CD40L的野生型小鼠模型中，血管緊張素Ⅱ升高導(dǎo)致的高血壓常伴有動(dòng)脈內(nèi)血栓形成加速及靜脈內(nèi)大量白細(xì)胞聚集，而去除CD40及CD40L的小鼠模型能夠抵抗靜注血管緊張素Ⅱ造成的高凝及炎癥狀態(tài)[15]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第3天，3組產(chǎn)婦血漿的sCD40L水平及外周血PBMC的CD40相對(duì)表達(dá)水平由高到低均為對(duì)照組、稀釋組、聯(lián)合治療組(均P<0.05)，且聯(lián)合治療組、稀釋組產(chǎn)婦的血漿sCD40L水平及外周血PBMC的CD40相對(duì)表達(dá)水平均低于手術(shù)當(dāng)天(均P<0.05)，這提示ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可明顯降低機(jī)體CD40/CD40L系統(tǒng)水平。已有研究表明，CD40L和sCD40L屬于腫瘤壞死因子超家族成員，是具有促凝和促炎雙重作用的分子，CD40/CD40L系統(tǒng)水平是與炎癥和凝血有關(guān)的一種信號(hào)通路，ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療可能通過(guò)減輕炎癥應(yīng)激反應(yīng)、改善凝血功能及局部微循環(huán)等機(jī)制，降低產(chǎn)婦CD40/CD40L系統(tǒng)水平[16]。

綜上所述，ANH自體輸血聯(lián)合空氣波壓力治療能有效地降低剖宮產(chǎn)術(shù)后產(chǎn)婦血漿D-二聚體、hs-CRP、sCD40L水平和外周血PBMC的CD40相對(duì)表達(dá)水平，預(yù)防LEDVT的形成。但是本研究所納入的臨床樣本量有限，后期仍需要在大規(guī)模樣本中進(jìn)行研究。