薛林濤 王世凱 覃 捷

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧市 530021，電子郵箱：ltxgxh@163.com)

【提要】 卵質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)是治療男性不育的有效手段，但是ICSI周期完全受精失敗的發(fā)生率為2%～3%，同時男性精子嚴(yán)重畸形僅采用ICSI治療仍無法正常受精。卵子激活障礙是導(dǎo)致受精失敗的最主要因素，而卵子輔助激活可以人工誘發(fā)鈣振蕩激活卵子，促進正常受精。近年來卵母細(xì)胞人工激活在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛，成為治療ICSI受精失敗的主要輔助技術(shù)，但該技術(shù)臨床應(yīng)用的安全性仍存爭議。本文就人卵子輔助激活技術(shù)在ICSI受精失敗中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及其研究進展進行綜述。

卵質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)是通過顯微操作將單個精子注入卵胞質(zhì)內(nèi)以完成受精，該技術(shù)的出現(xiàn)解決了男方及受精障礙等因素導(dǎo)致不育疾病的問題，是目前治療男性不育最有效的技術(shù)手段。但ICSI周期中仍然有2%～3%的患者發(fā)生完全受精失敗，ICSI后卵子的受精率約為70～80%，還有20%～30%的成熟卵子即使注射精子后仍無法受精，同時男性精子形態(tài)嚴(yán)重畸形(如圓頭精子癥)僅采用ICSI治療仍無法正常受精。有研究發(fā)現(xiàn)，卵子激活障礙是導(dǎo)致ICSI受精失敗的最主要因素[1]，而卵母細(xì)胞人工激活(artificial oocyte activation,AOA)技術(shù)能夠成功誘發(fā)卵子鈣振蕩，激活卵子恢復(fù)第二次減數(shù)分裂促進受精完成，在圓頭精子癥[2]、反復(fù)ICSI受精失敗[3]等患者中應(yīng)用可以顯著提高受精率，改善臨床結(jié)局。目前AOA在輔助生殖助孕周期中的應(yīng)用越來越廣泛。本文就AOA的技術(shù)原理、臨床應(yīng)用及其研究進展做一綜述。

1 ICSI受精失敗的原因及機制

ICSI受精失敗的原因主要分為卵源性和精源性兩方面因素：(1)卵子質(zhì)量是保證受精成功的前提，只有當(dāng)卵母細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核同步成熟，才能對精子進入卵子后釋放的因子發(fā)生充分應(yīng)答，引發(fā)鈣振蕩，激活卵母細(xì)胞。有學(xué)者對受精失敗的卵母細(xì)胞進行超微結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞染色體分布、紡錘體結(jié)構(gòu)及其他細(xì)胞器分布異常，這提示卵母細(xì)胞核質(zhì)不成熟或成熟不同步會導(dǎo)致受精失敗[4]。另外，卵母細(xì)胞的基因功能缺陷也會導(dǎo)致受精失敗，有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞特異表達的蛋白激酶Wee發(fā)生純合突變可導(dǎo)致受精失敗[5]。(2)即使成熟的卵細(xì)胞在精子注射后也會發(fā)生受精失敗，這種現(xiàn)象主要是由于精子未能成功誘發(fā)鈣振蕩激活卵細(xì)胞所致，目前認(rèn)為精子磷脂酶C ζ(phospholipase C zeta，PLCζ)是誘發(fā)鈣震蕩的特異性因子[6]。精子中的PLCζ處于一種失活狀態(tài)，精子與卵子融合時開始活化，PLCζ通過分解磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸(phosphatidylinositol-4,5-biphosphate,PIP2)產(chǎn)生肌醇1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)，IP3結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的特異性受體，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放，而Ca2+濃度的增加使PLCζ活性增強，進一步正反饋調(diào)節(jié)IP3及Ca2+的釋放，使Ca2+濃度進一步升高，當(dāng)Ca2+達到臨界濃度時，通過Ca2+通道的調(diào)節(jié)，使胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，至此鈣振蕩的單個波峰形成。PLCζ的表達異常包括表型異常和功能異常，均會導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活失敗，同時，PLCζ的活性位點殘基相對保守，其突變也可能導(dǎo)致PLCζ誘導(dǎo)Ca2+能力喪失[7]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，PLCζ基因敲除雄鼠的生育力只是降低，并非完全喪失，這提示卵子中也可能存在其他替代信號通路在PLCζ缺失的情況下起部分激活卵子的作用[8]，這有待于進一步研究。

2 AOA治療的技術(shù)原理及臨床應(yīng)用

自然受精時精子中的PLCζ等釋放入卵子觸發(fā)鈣振蕩，而AOA技術(shù)是通過電刺激或化學(xué)制劑等方式處理卵子，激發(fā)胞外Ca2+內(nèi)流從而模擬自然受精激活卵子誘發(fā)鈣振蕩[9]，這可以在一定程度上彌補精卵激活障礙導(dǎo)致的缺陷，人工誘導(dǎo)卵子恢復(fù)第二次減數(shù)分裂，完成正常受精過程，從而提高受精成功率。

目前AOA技術(shù)在因男性不育因素如圓頭精子癥等所致的ICSI受精失敗患者中應(yīng)用廣泛，Taylor等[2]研究發(fā)現(xiàn)，對于圓頭精子癥患者采用AOA技術(shù)可以克服精子頂體缺失無法激活卵子的缺陷，成功受精并獲得活產(chǎn)胎兒。Sfontouris等[10]對ICSI受精失敗的患者進行AOA治療，發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高受精率，同時對于通過睪丸手術(shù)取精的精子來源的ICSI周期，應(yīng)用AOA技術(shù)有助于改善受精結(jié)局[11]。Karabulut等[12]研究認(rèn)為解凍的精子經(jīng)ICSI后采用AOA治療能夠改善胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局，避免精子凍融導(dǎo)致的不利影響。另外還有研究采用胚胎延時攝影技術(shù)監(jiān)測ICSI卵子第二極體的排出情況，以此作為早期受精成敗的判斷標(biāo)準(zhǔn)，對不能正常排出第二極體的卵子進行AOA治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該干預(yù)措施能夠獲得正常受精并獲得理想的胚胎發(fā)育結(jié)局，并提高卵子利用率[13]。

近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，AOA不僅能夠改善激活障礙導(dǎo)致的受精失敗，對于胚胎發(fā)育阻滯、反復(fù)周期胚胎質(zhì)量差的患者可能也有一定的治療作用。Darwish等[14]對ICSI受精后原核期發(fā)育阻滯的患者，在下一個治療周期使用鈣離子激活劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精卵可以突破阻滯進而正常分裂；Kashir等[8]認(rèn)為對于胚胎發(fā)育阻滯、反復(fù)周期胚胎質(zhì)量差或者反復(fù)植入失敗的患者應(yīng)用AOA可以改善臨床治療結(jié)局。

3 AOA治療的研究進展

目前臨床上常用的AOA方法包括電刺激激活法、機械激活法和化學(xué)激活法。電刺激激活法主要原理是通過電脈沖作用于卵母細(xì)胞質(zhì)膜上使其形成小孔，促進Ca2+內(nèi)流從而激活卵母細(xì)胞[15]。機械激活法則通過在顯微鏡下反復(fù)抽吸胞漿等機械方式達到激活卵子的目的[16]?；瘜W(xué)激活法主要通過鈣離子載體等化學(xué)試劑對ICSI受精卵子進行孵育處理，通過增加細(xì)胞膜的Ca2+通道通透性使胞外Ca2+內(nèi)流激活卵母細(xì)胞，該方法也是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的激活方式。

鈣離子載體A23187及離子霉素是目前AOA相關(guān)研究中使用最廣泛的激活試劑，其可以誘發(fā)單次Ca2+水平波狀升高，已被多項研究證實可以成功激活卵子。Darwish等[14]對既往有完全受精失敗史和卵裂失敗史的不孕癥夫婦進行ICSI后，再使用鈣離子載體A23187進行AOA治療，發(fā)現(xiàn)受精率和卵裂率顯著改善，并有活產(chǎn)胎兒出生。Borges等[17]對不同類型來源的精子進行ICSI后使用鈣離子載體A23187進行AOA治療，發(fā)現(xiàn)該方法可以顯著增加手淫精子和附睪精子的受精率及胚胎發(fā)育結(jié)局。還有研究對比了行AOA治療時鈣離子載體A23187和離子霉素的激活效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠動物模型中離子霉素對卵母細(xì)胞的激活效率優(yōu)于鈣離子載體A23187，但在人體外成熟卵子中兩種激活試劑的激活效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[18]。但值得注意的是，有研究認(rèn)為鈣離子載體A23187、離子霉素等只能誘發(fā)單次Ca2+水平升高，并不能模擬自然受精發(fā)生的多次鈣振蕩波，而SrCl2、PLCζ理論上可誘發(fā)多重鈣振蕩，更接近自然受精過程[19]。Vanden Meerschaut等[20]對小鼠卵子進行ICSI后，比較SrCl2、電脈沖和離子霉素的激活效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SrCl2激活效果優(yōu)于離子霉素。Fawzy等[21]比較了SrCl2和鈣離子載體A23187在ICSI后受精率低或完全不受精的男性患者中的治療效果，發(fā)現(xiàn)既往ICSI受精率低的患者使用SrCl2進行AOA治療的臨床結(jié)局更好，而前次完全受精失敗的患者使用鈣離子載體A23187治療更有效。PLCζ作為精子特異性的卵子激活因子，也是一種理想的激活劑，Sanusi 等[22]研究證實重組人PLCζ可以有效激活小鼠卵子；而向ICSI后受精失敗的人卵母細(xì)胞顯微注射重組人PLCζ也可以激活卵子并進一步促進卵裂[23]。但由于目前重組人PLCζ生產(chǎn)純化的技術(shù)尚不穩(wěn)定，仍未大量生產(chǎn)，在臨床中尚未得到應(yīng)用。如何模擬自然受精狀態(tài)的鈣振蕩波的輔助激活方法，從而提高AOA治療效率是將來的研究方向。

4 AOA治療的安全性

一直以來，關(guān)于AOA治療的安全性始終是學(xué)者爭論的焦點。雖然已有研究證實AOA可以顯著改善受精結(jié)局，且已有活產(chǎn)胎兒分娩，但是化學(xué)激活劑對胚胎發(fā)育的潛在作用、非生理性卵子激活模式對胚胎基因表達以及對子代表觀遺傳的影響等，都是值得進一步研究的問題。

Vanden Meerschaut等[20]采用氯化鍶分別結(jié)合電刺激和離子霉素激活小鼠經(jīng)ICSI后的卵子，結(jié)果顯示兩種激活方法均可獲得健康且有生育能力的小鼠，小鼠后代未見明顯畸形。Miller等[24]對接受AOA治療后出生的新生兒進行分析，未發(fā)現(xiàn)新生兒出生缺陷及發(fā)育異常。Vanden Meerschaut等[25]對經(jīng)AOA治療后出生的21名3～10歲兒童進行隨訪，發(fā)現(xiàn)這些兒童的神經(jīng)發(fā)育和行為表現(xiàn)指標(biāo)均與正常兒童無明顯差異。但由于研究樣本量有限，同時缺乏針對子代遠期影響的研究結(jié)果，AOA治療的安全性仍需進一步研究，且需要嚴(yán)格把握臨床治療指征和患者知情同意原則，確保AOA技術(shù)在臨床應(yīng)用的安全性。

5 結(jié) 語

ICSI受精失敗后采用AOA治療可以獲得一定的臨床效果，尤其對于ICSI完全受精失敗或精子頂體形態(tài)異?；颊?，可以顯著改善受精結(jié)局，提高臨床治療成功率。有關(guān)AOA技術(shù)的研究正在逐步開展，研發(fā)更貼近自然受精狀態(tài)的激活模式是今后研究的趨勢，我們在關(guān)注AOA技術(shù)帶來臨床獲益的同時也應(yīng)關(guān)注其安全性，探討該技術(shù)對子代遺傳改變及遠期發(fā)育的影響，從而為AOA技術(shù)在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。