王聰亮,張政軒，付 琪，魏宇新，白晶晶，宋曉越，李隴平，屈 雷，朱海鯨,2,3*

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)研究中心，陜西榆林 719000；2.陜西省“四主體一聯(lián)合”肉羊工程技術(shù)校企聯(lián)合研究中心，陜西神木 719318；3.陜西浩麗絨山羊科技發(fā)展有限公司，陜西子洲 718499)

催乳素(Prolactin,PRL)主要是垂體前葉分泌的一種肽類激素，僅包含1個(gè)跨膜區(qū)域的膜結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于乳腺、卵巢、睪丸等組織，PRL通過與其受體(PRLR)結(jié)合作用于靶器官，參與調(diào)控乳腺發(fā)育、黃體生成、調(diào)節(jié)滲透壓等及繁殖相關(guān)激素分泌等多種生理活動(dòng)。按照PRLR受體胞內(nèi)域氨基酸數(shù)目和胞質(zhì)區(qū)域組成可分為長型PRLR、中型PRLR和短型PRLR，其功能各不相同。據(jù)報(bào)道，PRL在大鼠、綿羊和牛等多個(gè)物種內(nèi)分布廣泛，通過與不同PRLR受體亞型結(jié)合介導(dǎo)，作用于相應(yīng)靶細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。

基因作為泌乳相關(guān)基因，研究人員發(fā)現(xiàn)，基因與母豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，可作為豬高產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因，國內(nèi)外研究人員就基因?qū)π笄菝谌楹头敝承誀畹挠绊懻归_大量研究。如，基因側(cè)翼區(qū)一處SNP突變與疆岳驢平均日泌乳量和乳蛋白率顯著相關(guān)，可作為乳用型疆岳驢選育的有效DNA標(biāo)記。此外，基因也可作為高產(chǎn)仔數(shù)和海門山羊選育的重要候選基因。但基因多態(tài)并不是都與動(dòng)物繁殖相關(guān)，如基因多個(gè)SNP突變位點(diǎn)與湖羊和濟(jì)寧青山羊等數(shù)個(gè)品種的產(chǎn)羔性狀無顯著關(guān)聯(lián)。陜北白絨山羊作為優(yōu)秀絨肉兼用品種，目前關(guān)于基因與陜北白絨山羊生產(chǎn)相關(guān)性狀的研究較少。為此，筆者采用PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)探究基因InDel多態(tài)性及其與不同陜北白絨山羊群體生產(chǎn)性狀的相關(guān)性，以期為絨山羊的高效選育提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)羊由陜西應(yīng)馬安絨山羊養(yǎng)殖公司提供，包括618只育成羊(1.0～1.5歲)和558只成年羊(1.5～4.0歲)，均為雌性。剪取試驗(yàn)羊耳尖部約0.4 cm耳組織儲存在含有70 %乙醇的1.5 mL Eppedorff管中，同時(shí)測量試驗(yàn)羊體重、體高、體長、胸圍、髖寬、管圍、十字部高、胸深、胸寬、絨細(xì)度10個(gè)性狀數(shù)據(jù)。同時(shí)提取試驗(yàn)羊耳組織DNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

瓊脂糖、Marker 1和PCR Master Mix，均購自天根生化科技(北京)有限公司；EB核酸染料，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

參照文獻(xiàn)[13]，選取基因第2內(nèi)含子16 bp InDel突變位點(diǎn)(NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)作為候選變異位點(diǎn)，并利用文獻(xiàn)中的引物對候選變異位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測?；虻腜CR擴(kuò)增體系：PCR Master Mix 6.5 μL，上下游引物各0.3 μL，模板DNA 0.7 μL，ddHO補(bǔ)至13 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)保存，擴(kuò)增目的片段長度分別為143 bp和127 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳并鑒定分型，引物合成與PCR產(chǎn)物測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

利用Microsoft Excel 2018軟件計(jì)算基因InDel突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，使用Nei方法計(jì)算基因純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)等群體遺傳學(xué)參數(shù)，使用在線平臺SHEsis(https://analysis.bio-x.cn)計(jì)算基因多態(tài)性是否處于哈代溫伯格(HWE)平衡。其生物統(tǒng)計(jì)模型為=++，其中為總體平均值，為基因型固定效應(yīng)，為隨機(jī)誤差。利用SPSS 23.0軟件，分別運(yùn)用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)和單因素方差方法完成基因陜北白絨山羊育成羊和成年羊群體不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析；再利用Microsoft Excel 2018軟件計(jì)算不同群體各個(gè)性狀表型值的平均值，用個(gè)體表型值減去平均值得到差值，運(yùn)用單因素方差方法分析不同基因型與陜北白絨山羊群體生長性狀之間的差異顯著性，其中育成羊和成年羊?yàn)橐粋€(gè)整體，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。陜北白絨山羊基因16 bp InDel位點(diǎn)(NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)具有多態(tài)性，分別產(chǎn)生了純合插入型(II，143 bp)、雜合型(ID，143 bp和127 bp)與純合缺失型(DD，127 bp)3種基因型，產(chǎn)物測序結(jié)果見圖2，測序結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果一致。

注：M.Marker;1,5.ID型;2,3,6.II型;4.DD型Note:M.Marker;1,5.ID type;2,3,6. II type;4.DD type圖1 PRLR基因16 bp InDel位點(diǎn)凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Gel electroresis result of the PRLR gene 16 bp InDel site

圖2 PRLR基因16 bp InDel位點(diǎn)(NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)測序結(jié)果Fig.2 Sequencing result of the PRLR gene 16 bp InDel site (NC_030827.1.g.61200-61206,61209-61214,61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG)

基因16 bp InDel突變位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)性信息含量(PIC)等群體遺傳學(xué)參數(shù)見表1。結(jié)果顯示，基因16 bp InDel突變位點(diǎn)在陜北白絨山羊育成羊、成年羊和全部群體中均屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，I型等位基因頻率均高于D型；該突變位點(diǎn)在成年羊群體處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(>0.05)，但在育成羊和全部群體中偏離了哈代溫伯格平衡(<0.05)。

表1 陜北白絨山羊群體PRLR基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳參數(shù)結(jié)果Table 1 Results of genetic parameters of PRLR gene polymorphism locus in Shanbei white cashmere goats

通過SPSS 23.0軟件對基因InDel位點(diǎn)多態(tài)性與不同陜北白絨山羊群體生長性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2～4。在陜北白絨山羊育成羊群體中(=618)，由于體重和絨細(xì)度性狀DD基因型只有2個(gè)樣本，故運(yùn)用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)法對其進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示不同基因型與生長性狀均無顯著關(guān)聯(lián)(表2)；在成年羊群體中(=558)，ID基因型山羊的管圍顯著高于II基因型(<0.05)(表3)；在育成羊和成年羊全部群體中(=1 176)，ID基因型山羊的管圍仍顯著高于II基因型(<0.05)，優(yōu)勢基因型與成年羊群體相同，均為ID型(表4)。

表2 陜北白絨山羊育成羊PRLR基因多態(tài)位點(diǎn)對生長性狀影響的測定結(jié)果(n=618)Table 2 Results of determining the effect of PRLR gene polymorphic loci on growth traits in yearling period of Shanbei white cashmere goats (n=618)

表3 陜北白絨山羊成年羊PRLR基因多態(tài)位點(diǎn)對生長性狀影響的測定結(jié)果(n=558)Table 3 Results of determining the effect of PRLR gene polymorphic loci on growth traits in adult period of Shanbei white cashmere goats(n=558)

表4 陜北白絨山羊群體PRLR基因多態(tài)位點(diǎn)對生長性狀影響的測定結(jié)果(n=1 176)Table 4 Results of determining the effect of PRLR gene polymorphic loci on growth traits in all of Shanbei white cashmere goats(n=1 176)

3 討論

陜北白絨山羊作為國內(nèi)知名絨肉兼用山羊品種，其中陜北地區(qū)是重要養(yǎng)殖區(qū)域，產(chǎn)肉性能及遺傳穩(wěn)定性差等是養(yǎng)殖過程中的主要問題。相對傳統(tǒng)育種方法而言，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(MAS)具有選擇準(zhǔn)確度高、育種周期短等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于家畜育種，用于改良家畜經(jīng)濟(jì)性狀，提高生產(chǎn)性能。

多態(tài)信息含量等與基因遺傳多樣性往往具有直接關(guān)系。該突變多態(tài)信息含量顯示，在陜北白絨山羊不同群體中均屬于低度多態(tài)水平(PIC<0.25)，說明群體遺傳變異較小，可適當(dāng)加強(qiáng)選擇強(qiáng)度，但在育成羊和全部群體中偏離了哈代溫伯格平衡(<0.05)，說明可能受到遺傳漂變及人工選育的影響，而陜北白絨山羊正是人工選育與雜交形成的新品種，等位基因流失可能是其主要影響因素。將基因16 bp InDel突變位點(diǎn)多態(tài)性與陜北白絨山羊的生長性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，該突變位點(diǎn)與陜北白絨山羊育成羊生長性狀無顯著關(guān)聯(lián)，但與成年羊管圍性狀顯著相關(guān)；當(dāng)把育成羊和成年羊作為一個(gè)群體分析時(shí)，該InDel突變位點(diǎn)仍與管圍性狀顯著相關(guān)，優(yōu)勢基因型與成年羊群體相同，均為ID型，具有很好的一致性。在成年羊群體中，該突變位點(diǎn)能顯著影響山羊的管圍性狀，但對育成羊生長性狀無顯著影響，推測可能存在以下原因：①生長發(fā)育階段不同，育成羊尚未發(fā)育完善；②基因表達(dá)存在時(shí)序性，如基因在牦牛生長發(fā)育后期睪丸組織中的表達(dá)量極顯著高于前期，同時(shí)5日齡與8周齡雌性大鼠肝臟組織中基因表達(dá)量有較大差異，故基因可能在陜北白絨山羊不同生長發(fā)育階段存在差異表達(dá)。同時(shí)研究顯示，羊體質(zhì)量與管圍性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，表明基因該突變位點(diǎn)可能會間接影響陜北白絨山羊體重性狀，其中具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

有報(bào)道稱，基因分別定位于綿羊、山羊的16、20號染色體，其中在綿羊腹股溝竇、脂肪和山羊肌肉、肝臟及皮下脂肪中存在不同程度的基因表達(dá)。目前研究人員普遍認(rèn)為主要通過JAK2-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與機(jī)體調(diào)控，通過JAK2酪氨酸激酶的活化對STAT5轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化，從而形成同型二聚體，與靶基因啟動(dòng)子上的γ-干擾素激活位點(diǎn)序列特異性結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)并調(diào)控蛋白表達(dá)，除此之外，有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶途徑也被認(rèn)為是參與介導(dǎo)PRL調(diào)控作用的重要途徑。研究顯示，催乳素合成分泌與下丘腦多巴胺的調(diào)控有直接關(guān)系，多巴胺與催乳素細(xì)胞表面的多巴胺D2特異性結(jié)合，在小鼠中，缺乏多巴胺D2R受體亞型與其體重增加有直接關(guān)系，小鼠敲除基因后骨形成速率和骨密度較敲除前有所下降。研究證實(shí)，在調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，在刺激NIH3T3細(xì)胞快速增殖的同時(shí)還能有效促進(jìn)細(xì)胞分裂蛋白激酶的激活。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)，在牦牛等動(dòng)物肝臟、骨骼肌和腎臟均有較高表達(dá)水平，并且基因p.H406R和p.M480T 2個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)多態(tài)與大白豬背部脂肪有顯著影響，說明基因可能參與早期動(dòng)物胚胎及機(jī)體的生長發(fā)育。

綜上所述，基因16 bp InDel突變對陜北白絨山羊管圍性狀有顯著影響，可作為陜北白絨山羊優(yōu)良生長性狀選育的重要候選基因。

4 結(jié)論

該研究驗(yàn)證了基因在陜北白絨山羊群體中存在1個(gè)16 bp的插入缺失，并發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)對陜北白絨山羊群體部分生長性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，提示該位點(diǎn)可作為陜北白絨山羊分子標(biāo)記輔助育種的有效DNA標(biāo)記。