朱巧玲，鄒宇曉，廖森泰，孫遠(yuǎn)明，黎爾納*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610）

桑枝是桑樹的枝條，作為傳統(tǒng)中藥，含有黃酮、多糖、生物堿和氨基酸等活性成分[1]。多糖是桑枝的主要活性物質(zhì)，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成，其摩爾比為1.36∶2.68∶0.46∶328.17∶1.53∶21.80∶6.16[2]，具有緩解糖尿病、保護(hù)肝臟、提高免疫等藥理功效[3-5]。

多糖的活性與其分子量密切相關(guān)，降低分子量可提高其生理活性[6]。酶降解法采用特定酶斷裂分子內(nèi)部的糖苷鍵，從而降低聚合度及其分子量。與物理降解、化學(xué)降解相比，酶降解法反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、反應(yīng)迅速、無污染。采用酶法降解多糖可降低多糖的分子量，進(jìn)一步提高其生理活性，使其應(yīng)用范圍更加廣泛[7-9]。將大分子多糖酶解為小分子低聚糖已經(jīng)成為多糖開發(fā)利用的熱點(diǎn)，吳婷等[10]將葫蘆巴多糖酶解得到低聚糖片段，抑菌活性增強(qiáng)；燕麥β-葡聚糖、殼聚糖的抗菌活性同樣隨著分子量的降低逐漸增強(qiáng)[11-13]。

齲病的發(fā)生是由于變異鏈球菌利用蔗糖等產(chǎn)生不溶性葡聚糖，在牙齒表面形成齒垢，在齒垢中使糖發(fā)酵產(chǎn)酸，腐蝕牙齒，形成齲齒[14-17]。尋找無毒副作用又具備防齲性能的天然藥物已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。研究表明，低聚糖對(duì)病原微生物的生長(zhǎng)具有較好的抑制作用[18]，高濃度的低聚木糖可以抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)[19]，殼寡聚糖抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸、產(chǎn)糖和黏附[20]。低聚異麥芽糖無法被變異鏈球菌利用，降低產(chǎn)酸，且其中的潘糖可有效抑制齒垢的形成[21]。機(jī)體在新陳代謝的過程中產(chǎn)生自由基，自由基在口腔內(nèi)的大量存在會(huì)增加口腔疾病（齲齒、牙周病等）發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，并且在疾病發(fā)生過程中也起到關(guān)鍵作用[22]，添加外源性抗氧化劑可以起到預(yù)防口腔疾病的效果[23]。

目前，關(guān)于桑枝多糖的功能性研究主要有降血糖、降血脂和抗腫瘤等，而對(duì)桑枝低聚糖微生態(tài)產(chǎn)品研究較少。本試驗(yàn)以桑枝多糖為原材料，采用β-葡聚糖酶制備桑枝低聚糖，考察桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌抑制的效果，并用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備低聚糖工藝，研究桑枝低聚糖的抗氧化活性，為桑枝低聚糖在口腔保健類產(chǎn)品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑枝多糖（桑枝經(jīng)80℃水浸提3次每次2 h，減壓抽濾，濃縮，4倍體積無水乙醇醇沉，4℃靜置過夜，離心分離所得粗多糖，苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量約為70%）；腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；果膠酶（1 000 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）、β-葡聚糖酶（50 U/mg）、β-甘露聚糖酶（50U/mg）、木聚糖酶（6000U/mg）、糖化酶（100U/mg）：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；變異鏈球菌ATCC25175：廣東省微生物研究所菌種保藏中心；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 [2，2′-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2，2′-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）法]、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒[鐵離子還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法]：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除能力試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；試驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BP211D型電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器：江蘇省華美生化儀器廠；HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；synergyH1型酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱：海南雋譽(yù)科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 變異鏈球菌菌液的制備

取-80℃保存的變異鏈球菌ATCC25175接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧（80% N2、10% CO2、10% H2）培養(yǎng)24 h，經(jīng)鑒定及涂片檢查為純培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌懸液濃度約107CFU/mL，備用。

1.3.2 活菌總數(shù)與抑菌率測(cè)定

變異鏈球菌活菌數(shù)量的測(cè)定：稀釋倒平板法，參考GB4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[24]。接種1%菌液，37℃厭氧培養(yǎng)24h，以BHI液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組，將陰性對(duì)照組活菌總數(shù)設(shè)置為100%，變異鏈球菌抑菌率計(jì)算公式如下。

1.3.3 不同酶制備桑枝低聚糖抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

參考賈俊強(qiáng)等[25]對(duì)蛹蟲草多糖的酶解工藝并加以適當(dāng)修改，分別添加不同種類的酶（果膠酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、糖化酶）到桑枝多糖溶液中，調(diào)節(jié)至酶添加量為1 000 U/mL，50℃水浴加熱3 h，沸水浴10 min滅酶，冷卻離心（4 000 r/min，10 min）后取上清液即為桑枝低聚糖樣品，121℃高壓滅菌20 min，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明3 mg/mL桑枝多糖對(duì)變異鏈球菌的抑菌率接近半數(shù)抑菌率，因此選擇質(zhì)量濃度為3 mg/mL進(jìn)行后續(xù)酶解工藝優(yōu)化研究。分別添加不同酶酶解后的桑枝低聚糖、商品化低聚糖（低聚半乳糖、低聚異麥芽糖）、桑枝多糖至BHI液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為3 mg/mL。接種1%菌液，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，計(jì)算抑菌率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 酶添加量對(duì)抑菌率的影響

在桑枝低聚糖終質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的條件下，分別添加β-葡聚糖酶使酶添加量至200、400、600、800、1 000 U/mL，50℃水浴加熱3 h。考察酶添加量影響抑菌率的程度。

1.3.4.2 酶解溫度對(duì)抑菌率的影響

在桑枝低聚糖終質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的條件下，添加β-葡聚糖酶至400 U/mL，分別置于溫度為30、40、50、60、70 ℃水浴加熱 3 h。考察酶解溫度影響抑菌率的程度。

1.3.4.3 酶解時(shí)間對(duì)抑菌率的影響

在桑枝低聚糖終質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的條件下，添加β-葡聚糖酶至400 U/mL，40℃分別水浴加熱1、2、3、4、5、6 h。考察酶解時(shí)間影響抑菌率的程度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）為自變量，以變異鏈球菌抑菌率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)酶解條件在三因素三水平上進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 不同質(zhì)量濃度對(duì)桑枝低聚糖抑菌率的影響

將桑枝多糖、桑枝低聚糖分別添加到BHI液體培養(yǎng)基中，采用二倍稀釋法稀釋為6個(gè)濃度梯度，使質(zhì)量終濃度分別達(dá)到 0.75、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00 mg/mL。接種1%菌液，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，計(jì)算抑菌率。

1.3.7 桑枝低聚糖的抗氧化活性的測(cè)定

1.3.7.1 DPPH法

DPPH自由基有單電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收，醇溶液呈紫色，當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，與單電子配對(duì)使其吸收逐漸消失，呈現(xiàn)顏色較淺，吸光值越低。按照DPPH自由基清除能力試劑盒說明，將150 μL的樣品溶液加入到150 μL工作液中避光30 min，12 000 r/min離心5min，測(cè)定517nm處吸光度，記為A測(cè)定，以150μL 80%甲醇溶液和150 μL樣品溶液反應(yīng)，測(cè)吸光度，記為A對(duì)照，以150μL80%甲醇溶液和150μL工作液反應(yīng)，測(cè)吸光度，記為A空白。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率和清除能力。以同濃度的VC和低聚異麥芽糖溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7.2 ABTS法

ABTS在氧化劑的作用下會(huì)氧化成綠色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+自由基的形成受到抑制，測(cè)定其在734 nm的吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。按照總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）測(cè)定，將 10 μL 樣品溶液加入到 200 μL ABTS 工作液中，室溫孵育6 min后測(cè)定A734，以0.15 mmol/L～1.5 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)后溶液的A734為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，總抗氧化能力用Trolox當(dāng)量表示。以同濃度的VC和低聚異麥芽糖溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7.3 FRAP法

酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（ferric-tripyridy ltriazine，F(xiàn)e3+-TPTZ） 產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，在593 nm測(cè)定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的吸光值即可獲得樣品中的總抗氧化能力。按照總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP）測(cè)定，將5 μL樣品溶液加入到180 μL FRAP工作液中，37℃孵育5 min后測(cè)定 A593，以0.15 mmol/L～1.5 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)后溶液的A793為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，總抗氧化能力用FeSO4當(dāng)量表示。以同濃度的VC和低聚異麥芽糖溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值。采用GraphPadPrism7、Design Expert12.0和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類酶對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響

采用不同酶制得的桑枝低聚糖、商品化低聚糖（低聚異麥芽糖和低聚半乳糖）、桑枝多糖對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響如圖1所示。

圖1 不同種類酶對(duì)桑枝低聚糖抑制變異鏈球菌的影響Fig.1 The effect of different enzymes on the inhibition rate of Streptococcus mutans

不同酶制備的低聚糖抑菌率從高到低排序?yàn)棣?葡聚糖酶酶解產(chǎn)物＞低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖＞木聚糖酶酶解產(chǎn)物＞桑枝多糖＞果膠酶酶解產(chǎn)物＞糖化酶酶解產(chǎn)物＞纖維素酶酶解產(chǎn)物＞甘露聚糖酶酶解產(chǎn)物。結(jié)果表明β-葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物對(duì)變異鏈球菌的抑制效果較好，其對(duì)變異鏈球菌的抑菌率為（49.06±3.81）%，和其他酶解產(chǎn)物（除低聚半乳糖外）相比，抑菌率顯著提升（P＜0.05），與低聚半乳糖的抑菌率相比無顯著性差異（P＞0.05）。不同酶的作用位點(diǎn)有所不同，酶解獲得的產(chǎn)物存在差異?？赡苁且?yàn)棣?葡聚糖酶特異性地切斷桑枝多糖的 β-1，3-糖苷鍵、β-1，4-糖苷鍵，得到分子量較小的低聚糖片段，可以更快穿透菌體的細(xì)胞膜，增大細(xì)胞內(nèi)部滲透壓導(dǎo)致細(xì)菌死亡[29]，從而具有更高的抑菌活性。因此選擇β-葡聚糖酶進(jìn)行后續(xù)酶解研究。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶添加量對(duì)抑菌率的影響

β-葡聚糖酶添加量制備桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響見圖2。

圖2 酶添加量對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.2 The effect of enzyme addition on the inhibition rate of Streptococcus mutans

桑枝低聚糖的抑菌率隨酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在酶添加量為400 U/mL時(shí)抑菌率達(dá)到最大值（53.40±4.16）%，當(dāng)酶添加量大于400 U/mL時(shí)抑菌率隨之降低。在一定的底物濃度下，酶添加量較少時(shí)，酶尚未被飽和，酶添加量增加，酶解效率隨之升高[30]，生成的低聚糖增加，抑菌率隨之升高。酶添加量逐漸增加至一定程度，過量的酶將多糖水解為更小的片段，使其抑菌活性降低。因此選擇400U/mL為酶添加量最佳值。

2.2.2 酶解溫度對(duì)抑菌率的影響

不同酶解溫度制備的桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響如圖3所示。

圖3 酶解溫度對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis temperature on the inhibition rate of Streptococcus mutans

溫度從30℃升到40℃，抑菌率增加；溫度高于40℃后，抑菌率降低。在40℃時(shí)抑菌率最高，為（61.34±3.05）%。由于酶的活性與反應(yīng)溫度有關(guān)，酶在最適溫度發(fā)揮最大活性，超過其最適溫度，結(jié)構(gòu)變性，酶活力減弱，酶解程度降低。β-葡聚糖酶的最適溫度范圍為40℃～62℃[31]，因此選擇40℃為酶解溫度最佳值。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)抑菌率的影響

不同酶解時(shí)間制備的桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.4 The effect of enzymolysis time on the inhibition rate of Streptococcus mutans

桑枝低聚糖的抑菌率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先上升后慢速下降的趨勢(shì)，在3 h時(shí)達(dá)到最高值（61.85±3.39）%?？赡苁请S著時(shí)間的延長(zhǎng)，β-葡聚糖酶與糖鏈有更多的作用機(jī)會(huì)，生成更多的桑枝低聚糖，提高抑菌率。酶解時(shí)間過長(zhǎng)，過度降解，酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改變[32]，抑菌活性降低，從而降低了抑菌率。因此選擇3 h為酶解時(shí)間最佳值。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定酶添加量400 U/mL、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間3 h為響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，采用Design-Expert 12.0軟件，對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多元線性回歸二項(xiàng)式擬合，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Design and response value of Box-Behnken experiment

2.3.2 模型的建立與統(tǒng)計(jì)分析

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過優(yōu)化得到二次回歸方程：抑菌率=62.68+2.921 25A+6.275B+5.566 25C+0.677 5AB+0.37AC+1.537 5BC-4.032 5A2-9.385B2-5.017 5C2。由表3可知，模型的P值＜0.000 1，說明模型高度顯著，可信度高；模型R2=0.991 3，校正R2=0.980 0，模型可以很好地模擬和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，失擬項(xiàng)為0.096 0＞0.05，變異系數(shù)為2.32%，擬合度較好，置信度較高，模型可以預(yù)測(cè)實(shí)際試驗(yàn)值。因此可以選擇該模型來分析桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌抑菌率的變化。BC對(duì)響應(yīng)值有顯著影響，A、B、C、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響。從 F 值可知，各因素對(duì)抑制率的影響程度：酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶添加量。

2.3.3 響應(yīng)面分析

β-葡聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間3個(gè)因素交互作用對(duì)桑枝低聚糖抑菌率的影響見圖5～圖7。

圖5 酶解溫度和酶添加量的交互作用對(duì)抑菌率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzyme addition and enzymolysis temperature on inhibition of Steptococcus mutans

圖7 酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用對(duì)抑菌率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzymolysis time and enzymolysis temperature on inhibition of Steptococcus mutans

響應(yīng)面圖的曲線彎曲程度說明研究因素對(duì)抑菌率的影響程度，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著。由響應(yīng)面可知，曲面的彎曲程度較大，說明酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)抑菌率的影響較大。由圖5可知，固定酶解時(shí)間為3 h時(shí)，隨著酶解溫度和酶添加量的增加，桑枝低聚糖的抑菌率逐漸升高；酶解溫度和酶添加量增加到一定值后，抑菌率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。由圖6可知，固定酶解溫度為40℃時(shí)，抑菌率隨著酶解時(shí)間與酶添加量的增加先升高后降低。由圖7可知，固定酶添加量為400 U/mL時(shí)，酶解溫度和酶解時(shí)間增加，抑菌率隨之先升高后降低。因此，酶解溫度和酶添加量之間存在較明顯的交互作用，酶解時(shí)間與酶添加量之間的交互作用不顯著，而酶解時(shí)間與酶解溫度存在顯著的交互作用。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過預(yù)測(cè)分析，得到最佳酶解工藝條件：酶添加量484.951 U/mL，酶解溫度44.011℃，酶解時(shí)間3.631 h，抑制率預(yù)測(cè)值為66.319%；結(jié)合實(shí)際條件，將酶解條件修正為酶添加量為485 U/mL、酶解溫度為44℃、酶解時(shí)間為3.6 h，試驗(yàn)驗(yàn)證得到實(shí)際抑制率為（68.30±3.96）%，與預(yù)測(cè)值相符。因此，該模型較好地預(yù)測(cè)了桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌的抑菌率，可信度較高。

2.4 質(zhì)量濃度對(duì)桑枝低聚糖抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌的抑菌率見圖8。

圖8 不同濃度桑枝多糖對(duì)變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.8 The effect of different concentrations of Ramulus mori polysaccharides on the inhibition rate of Streptococcus mutans

桑枝多糖與桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且濃度與其抑菌活性呈正相關(guān)，隨著濃度的升高，抑菌率也隨之升高，同質(zhì)量濃度下桑枝低聚糖的抑菌率均高于桑枝多糖。質(zhì)量濃度超過6 mg/mL后，隨著濃度的升高，抑制率趨于平緩。在適宜濃度下，多糖與低聚糖溶液濃度升高，抑菌活性物質(zhì)含量增多，對(duì)菌體細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的破壞作用越強(qiáng)，抑菌效果隨之增強(qiáng)。濃度過高，培養(yǎng)基滲透壓過高，大部分細(xì)菌均脫水死亡，抑菌率趨于100%。質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，桑枝多糖和桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌的抑菌率分別為（40.52±4.38）%和（68.91±3.82）%。結(jié)果表明采用優(yōu)化后的酶解工藝制備桑枝低聚糖，對(duì)變異鏈球菌的抑菌率提高。

2.5 桑枝低聚糖的抗氧化活性

2.5.1 清除DPPH自由基能力

不同濃度桑枝低聚糖、桑枝多糖、低聚異麥芽糖與VC標(biāo)準(zhǔn)品的DPPH自由基清除能力如圖9所示。

圖9 桑枝低聚糖的清除DPPH自由基能力Fig.9 The ability of Ramulus mori oligosaccharides to scavenge DPPH free radicals

在0.75 mg/mL～24 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，桑枝低聚糖的DPPH自由基清除能力隨著低聚糖質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，存在明顯的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，逐漸趨于平緩。桑枝低聚糖的DPPH自由基清除能力在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)達(dá)到（302.76±12.60）μg Trolox/mL。相同質(zhì)量濃度下DPPH自由基清除能力：VC>桑枝低聚糖>桑枝多糖>低聚異麥芽糖。

2.5.2 清除ABTS+自由基能力

不同濃度桑枝低聚糖、桑枝多糖、低聚異麥芽糖與VC標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)ABTS+自由基的清除能力如圖10所示。

圖10 桑枝低聚糖的清除ABTS+自由基能力Fig.10 The ability of Ramulus mori oligosaccharides to scavenge ABTS+free radicals

在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，清除率逐漸增強(qiáng)。桑枝低聚糖的質(zhì)量濃度在12 mg/mL后清除率增加緩慢，在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，其ABTS+自由基清除率為（5.70±0.56）mmol/L Trolox，桑枝多糖的ABTS+自由基清除率為（1.28±0.49）mmol/L Trolox，低聚異麥芽糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力較弱，在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，其ABTS+自由基清除率僅為（0.18±0.03）mmol/L Trolox。相同質(zhì)量濃度下 ABTS+自由基清除能力：VC>桑枝低聚糖>桑枝多糖>低聚異麥芽糖。

2.5.3 對(duì)Fe3+的還原能力

不同濃度桑枝低聚糖、桑枝多糖、低聚異麥芽糖與VC標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)Fe3+的還原能力如圖11所示。

圖11 桑枝低聚糖的Fe3+還原能力Fig.11 The ability of Ramulus mori oligosaccharides to reduce Fe3+

在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，還原能力逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為24 mg/mL時(shí)，桑枝低聚糖的Fe3+還原能力為（63.24±3.66）mmol/L FeSO4，桑枝多糖的 Fe3+還原能力為（26.34±0.43）mmol/L FeSO4，低聚異麥芽糖對(duì)Fe3+的還原能力較弱，僅為（3.34±0.50）mmol/L FeSO4。相同質(zhì)量濃度下Fe3+的還原能力：VC>桑枝低聚糖>桑枝多糖>低聚異麥芽糖。

綜上，桑枝低聚糖對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基具有不同程度的清除能力，對(duì)Fe3+具有較好的還原能力。并且總抗氧化能力隨桑枝低聚糖濃度的升高而增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，較桑枝多糖有明顯提升，且強(qiáng)于低聚異麥芽糖。多糖的抗氧化活性與糖鏈上游離羥基相關(guān)，酶解后的低聚糖糖鏈縮短，暴露的游離羥基增多，可結(jié)合的自由基增多，抗氧化活性增強(qiáng)[33]。人體在新陳代謝的過程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，對(duì)組織細(xì)胞DNA造成損傷，誘發(fā)各種慢性疾病。口腔中存在大量自由基易引發(fā)齲齒、牙周病、咀嚼肌疾病等，清除口腔內(nèi)自由基有利于預(yù)防口腔疾病，所以桑枝低聚糖有望應(yīng)用于口腔保健用品。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化了桑枝低聚糖的酶解制備工藝。首先研究不同酶制備的桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌的抑制率，再以抑菌率為指標(biāo)，考察酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)桑枝低聚糖抑菌率的影響，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化桑枝低聚糖的制備工藝，并且探究了桑枝低聚糖的抗氧化能力。得到最佳制備工藝：β-葡聚糖酶添加量為485 U/mL，酶解時(shí)間3.6 h，酶解溫度44℃，在此條件下變異鏈球菌的抑制率為（68.30±3.96）%。各因素對(duì)桑枝低聚糖抑菌率的影響程度：酶解溫度>酶解時(shí)間>酶添加量。

在此制備工藝下的桑枝低聚糖對(duì)DPPH、ABTS+自由基均有清除作用，其總抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且桑枝低聚糖的抗氧化活性均高于同質(zhì)量濃度的商品化低聚糖。本試驗(yàn)探究了桑枝低聚糖對(duì)變異鏈球菌的抑制效果，為進(jìn)一步提高蠶桑資源的綜合利用提供技術(shù)參考。