朱巧玲，鄒宇曉，廖森泰，孫遠(yuǎn)明，黎爾納*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610）

桑枝是桑樹的枝條，作為傳統(tǒng)中藥，含有黃酮、多糖、生物堿和氨基酸等活性成分[1]。多糖是桑枝的主要活性物質(zhì)，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成，其摩爾比為1.36∶2.68∶0.46∶328.17∶1.53∶21.80∶6.16[2]，具有緩解糖尿病、保護(hù)肝臟、提高免疫等藥理功效[3-5]。

多糖的活性與其分子量密切相關(guān)，降低分子量可提高其生理活性[6]。酶降解法采用特定酶斷裂分子內(nèi)部的糖苷鍵，從而降低聚合度及其分子量。與物理降解、化學(xué)降解相比，酶降解法反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、反應(yīng)迅速、無污染。采用酶法降解多糖可降低多糖的分子量，進(jìn)一步提高其生理活性，使其應(yīng)用范圍更加廣泛[7-9]。將大分子多糖酶解為小分子低聚糖已經(jīng)成為多糖開發(fā)利用的熱點(diǎn)，吳婷等[10]將葫蘆巴多糖酶解得到低聚糖片段，抑菌活性增強(qiáng)；燕麥β-葡聚糖、殼聚糖的抗菌活性同樣隨著分子量的降低逐漸增強(qiáng)[11-13]。

齲病的發(fā)生是由于變異鏈球菌利用蔗糖等產(chǎn)生不溶性葡聚糖，在牙齒表面形成齒垢，在齒垢中使糖發(fā)酵產(chǎn)酸，腐蝕牙齒，形成齲齒[14-17]。尋找無毒副作用又具備防齲性能的天然藥物已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。研究表明，低聚糖對病原微生物的生長具有較好的抑制作用[18]，高濃度的低聚木糖可以抑制變異鏈球菌生長[19]，殼寡聚糖抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸、產(chǎn)糖和黏附[20]。低聚異麥芽糖無法被變異鏈球菌利用，降低產(chǎn)酸，且其中的潘糖可有效抑制齒垢的形成[21]。機(jī)體在新陳代謝的過程中產(chǎn)生自由基，自由基在口腔內(nèi)的大量存在會增加口腔疾?。x齒、牙周病等）發(fā)生的風(fēng)險，并且在疾病發(fā)生過程中也起到關(guān)鍵作用[22]，添加外源性抗氧化劑可以起到預(yù)防口腔疾病的效果[23]。

目前，關(guān)于桑枝多糖的功能性研究主要有降血糖、降血脂和抗腫瘤等，而對桑枝低聚糖微生態(tài)產(chǎn)品研究較少。本試驗(yàn)以桑枝多糖為原材料，采用β-葡聚糖酶制備桑枝低聚糖，考察桑枝低聚糖對變異鏈球菌抑制的效果，并用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備低聚糖工藝，研究桑枝低聚糖的抗氧化活性，為桑枝低聚糖在口腔保健類產(chǎn)品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑枝多糖（桑枝經(jīng)80℃水浸提3次每次2 h，減壓抽濾，濃縮，4倍體積無水乙醇醇沉，4℃靜置過夜，離心分離所得粗多糖，苯酚硫酸法檢測多糖含量約為70%）；腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；果膠酶（1 000 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）、β-葡聚糖酶（50 U/mg）、β-甘露聚糖酶（50U/mg）、木聚糖酶（6000U/mg）、糖化酶（100U/mg）：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；變異鏈球菌ATCC25175：廣東省微生物研究所菌種保藏中心；總抗氧化能力檢測試劑盒 [2，2′-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2，2′-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）法]、總抗氧化能力檢測試劑盒[鐵離子還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法]：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除能力試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；試驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BP211D型電子分析天平：德國賽多利斯公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器：江蘇省華美生化儀器廠；HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；synergyH1型酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱：海南雋譽(yù)科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 變異鏈球菌菌液的制備

取-80℃保存的變異鏈球菌ATCC25175接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧（80% N2、10% CO2、10% H2）培養(yǎng)24 h，經(jīng)鑒定及涂片檢查為純培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌懸液濃度約107CFU/mL，備用。

1.3.2 活菌總數(shù)與抑菌率測定

變異鏈球菌活菌數(shù)量的測定：稀釋倒平板法，參考GB4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[24]。接種1%菌液，37℃厭氧培養(yǎng)24h，以BHI液體培養(yǎng)基為陰性對照組，將陰性對照組活菌總數(shù)設(shè)置為100%，變異鏈球菌抑菌率計算公式如下。

1.3.3 不同酶制備桑枝低聚糖抑制變異鏈球菌生長的影響

參考賈俊強(qiáng)等[25]對蛹蟲草多糖的酶解工藝并加以適當(dāng)修改，分別添加不同種類的酶（果膠酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、糖化酶）到桑枝多糖溶液中，調(diào)節(jié)至酶添加量為1 000 U/mL，50℃水浴加熱3 h，沸水浴10 min滅酶，冷卻離心（4 000 r/min，10 min）后取上清液即為桑枝低聚糖樣品，121℃高壓滅菌20 min，4℃儲存?zhèn)溆?。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明3 mg/mL桑枝多糖對變異鏈球菌的抑菌率接近半數(shù)抑菌率，因此選擇質(zhì)量濃度為3 mg/mL進(jìn)行后續(xù)酶解工藝優(yōu)化研究。分別添加不同酶酶解后的桑枝低聚糖、商品化低聚糖（低聚半乳糖、低聚異麥芽糖）、桑枝多糖至BHI液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為3 mg/mL。接種1%菌液，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，計算抑菌率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 酶添加量對抑菌率的影響

在桑枝低聚糖終質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的條件下，分別添加β-葡聚糖酶使酶添加量至200、400、600、800、1 000 U/mL，50℃水浴加熱3 h?？疾烀柑砑恿坑绊懸志实某潭?。

1.3.4.2 酶解溫度對抑菌率的影響

在桑枝低聚糖終質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的條件下，添加β-葡聚糖酶至400 U/mL，分別置于溫度為30、40、50、60、70 ℃水浴加熱 3 h?？疾烀附鉁囟扔绊懸志实某潭取?/p>

1.3.4.3 酶解時間對抑菌率的影響

在桑枝低聚糖終質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的條件下，添加β-葡聚糖酶至400 U/mL，40℃分別水浴加熱1、2、3、4、5、6 h。考察酶解時間影響抑菌率的程度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）為自變量，以變異鏈球菌抑菌率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法對酶解條件在三因素三水平上進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 不同質(zhì)量濃度對桑枝低聚糖抑菌率的影響

將桑枝多糖、桑枝低聚糖分別添加到BHI液體培養(yǎng)基中，采用二倍稀釋法稀釋為6個濃度梯度，使質(zhì)量終濃度分別達(dá)到 0.75、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00 mg/mL。接種1%菌液，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，計算抑菌率。

1.3.7 桑枝低聚糖的抗氧化活性的測定

1.3.7.1 DPPH法

DPPH自由基有單電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收，醇溶液呈紫色，當(dāng)自由基清除劑存在時，與單電子配對使其吸收逐漸消失，呈現(xiàn)顏色較淺，吸光值越低。按照DPPH自由基清除能力試劑盒說明，將150 μL的樣品溶液加入到150 μL工作液中避光30 min，12 000 r/min離心5min，測定517nm處吸光度，記為A測定，以150μL 80%甲醇溶液和150 μL樣品溶液反應(yīng)，測吸光度，記為A對照，以150μL80%甲醇溶液和150μL工作液反應(yīng)，測吸光度，記為A空白。按下式計算DPPH自由基清除率和清除能力。以同濃度的VC和低聚異麥芽糖溶液作為陽性對照。

1.3.7.2 ABTS法

ABTS在氧化劑的作用下會氧化成綠色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在時ABTS+自由基的形成受到抑制，測定其在734 nm的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。按照總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）測定，將 10 μL 樣品溶液加入到 200 μL ABTS 工作液中，室溫孵育6 min后測定A734，以0.15 mmol/L～1.5 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)后溶液的A734為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的總抗氧化能力，總抗氧化能力用Trolox當(dāng)量表示。以同濃度的VC和低聚異麥芽糖溶液作為陽性對照。

1.3.7.3 FRAP法

酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（ferric-tripyridy ltriazine，F(xiàn)e3+-TPTZ） 產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，在593 nm測定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的吸光值即可獲得樣品中的總抗氧化能力。按照總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP）測定，將5 μL樣品溶液加入到180 μL FRAP工作液中，37℃孵育5 min后測定 A593，以0.15 mmol/L～1.5 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)后溶液的A793為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的總抗氧化能力，總抗氧化能力用FeSO4當(dāng)量表示。以同濃度的VC和低聚異麥芽糖溶液作為陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值。采用GraphPadPrism7、Design Expert12.0和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類酶對變異鏈球菌抑菌率的影響

采用不同酶制得的桑枝低聚糖、商品化低聚糖（低聚異麥芽糖和低聚半乳糖）、桑枝多糖對變異鏈球菌抑菌率的影響如圖1所示。

圖1 不同種類酶對桑枝低聚糖抑制變異鏈球菌的影響Fig.1 The effect of different enzymes on the inhibition rate of Streptococcus mutans

不同酶制備的低聚糖抑菌率從高到低排序?yàn)棣?葡聚糖酶酶解產(chǎn)物＞低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖＞木聚糖酶酶解產(chǎn)物＞桑枝多糖＞果膠酶酶解產(chǎn)物＞糖化酶酶解產(chǎn)物＞纖維素酶酶解產(chǎn)物＞甘露聚糖酶酶解產(chǎn)物。結(jié)果表明β-葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物對變異鏈球菌的抑制效果較好，其對變異鏈球菌的抑菌率為（49.06±3.81）%，和其他酶解產(chǎn)物（除低聚半乳糖外）相比，抑菌率顯著提升（P＜0.05），與低聚半乳糖的抑菌率相比無顯著性差異（P＞0.05）。不同酶的作用位點(diǎn)有所不同，酶解獲得的產(chǎn)物存在差異?？赡苁且?yàn)棣?葡聚糖酶特異性地切斷桑枝多糖的 β-1，3-糖苷鍵、β-1，4-糖苷鍵，得到分子量較小的低聚糖片段，可以更快穿透菌體的細(xì)胞膜，增大細(xì)胞內(nèi)部滲透壓導(dǎo)致細(xì)菌死亡[29]，從而具有更高的抑菌活性。因此選擇β-葡聚糖酶進(jìn)行后續(xù)酶解研究。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶添加量對抑菌率的影響

β-葡聚糖酶添加量制備桑枝低聚糖對變異鏈球菌抑菌率的影響見圖2。

圖2 酶添加量對變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.2 The effect of enzyme addition on the inhibition rate of Streptococcus mutans

桑枝低聚糖的抑菌率隨酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在酶添加量為400 U/mL時抑菌率達(dá)到最大值（53.40±4.16）%，當(dāng)酶添加量大于400 U/mL時抑菌率隨之降低。在一定的底物濃度下，酶添加量較少時，酶尚未被飽和，酶添加量增加，酶解效率隨之升高[30]，生成的低聚糖增加，抑菌率隨之升高。酶添加量逐漸增加至一定程度，過量的酶將多糖水解為更小的片段，使其抑菌活性降低。因此選擇400U/mL為酶添加量最佳值。

2.2.2 酶解溫度對抑菌率的影響

不同酶解溫度制備的桑枝低聚糖對變異鏈球菌抑菌率的影響如圖3所示。

圖3 酶解溫度對變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis temperature on the inhibition rate of Streptococcus mutans

溫度從30℃升到40℃，抑菌率增加；溫度高于40℃后，抑菌率降低。在40℃時抑菌率最高，為（61.34±3.05）%。由于酶的活性與反應(yīng)溫度有關(guān)，酶在最適溫度發(fā)揮最大活性，超過其最適溫度，結(jié)構(gòu)變性，酶活力減弱，酶解程度降低。β-葡聚糖酶的最適溫度范圍為40℃～62℃[31]，因此選擇40℃為酶解溫度最佳值。

2.2.3 酶解時間對抑菌率的影響

不同酶解時間制備的桑枝低聚糖對變異鏈球菌抑菌率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.4 The effect of enzymolysis time on the inhibition rate of Streptococcus mutans

桑枝低聚糖的抑菌率隨著酶解時間的延長而呈現(xiàn)先上升后慢速下降的趨勢，在3 h時達(dá)到最高值（61.85±3.39）%?？赡苁请S著時間的延長，β-葡聚糖酶與糖鏈有更多的作用機(jī)會，生成更多的桑枝低聚糖，提高抑菌率。酶解時間過長，過度降解，酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改變[32]，抑菌活性降低，從而降低了抑菌率。因此選擇3 h為酶解時間最佳值。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定酶添加量400 U/mL、酶解溫度40℃、酶解時間3 h為響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，采用Design-Expert 12.0軟件，對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多元線性回歸二項(xiàng)式擬合，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值Table 2 Design and response value of Box-Behnken experiment

2.3.2 模型的建立與統(tǒng)計分析

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過優(yōu)化得到二次回歸方程：抑菌率=62.68+2.921 25A+6.275B+5.566 25C+0.677 5AB+0.37AC+1.537 5BC-4.032 5A2-9.385B2-5.017 5C2。由表3可知，模型的P值＜0.000 1，說明模型高度顯著，可信度高；模型R2=0.991 3，校正R2=0.980 0，模型可以很好地模擬和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，失擬項(xiàng)為0.096 0＞0.05，變異系數(shù)為2.32%，擬合度較好，置信度較高，模型可以預(yù)測實(shí)際試驗(yàn)值。因此可以選擇該模型來分析桑枝低聚糖對變異鏈球菌抑菌率的變化。BC對響應(yīng)值有顯著影響，A、B、C、A2、B2、C2對響應(yīng)值有極顯著影響。從 F 值可知，各因素對抑制率的影響程度：酶解溫度＞酶解時間＞酶添加量。

2.3.3 響應(yīng)面分析

β-葡聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間3個因素交互作用對桑枝低聚糖抑菌率的影響見圖5～圖7。

圖5 酶解溫度和酶添加量的交互作用對抑菌率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzyme addition and enzymolysis temperature on inhibition of Steptococcus mutans

圖7 酶解時間和酶解溫度的交互作用對抑菌率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzymolysis time and enzymolysis temperature on inhibition of Steptococcus mutans

響應(yīng)面圖的曲線彎曲程度說明研究因素對抑菌率的影響程度，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著。由響應(yīng)面可知，曲面的彎曲程度較大，說明酶添加量、酶解溫度和酶解時間的交互作用對抑菌率的影響較大。由圖5可知，固定酶解時間為3 h時，隨著酶解溫度和酶添加量的增加，桑枝低聚糖的抑菌率逐漸升高；酶解溫度和酶添加量增加到一定值后，抑菌率呈現(xiàn)下降的趨勢。由圖6可知，固定酶解溫度為40℃時，抑菌率隨著酶解時間與酶添加量的增加先升高后降低。由圖7可知，固定酶添加量為400 U/mL時，酶解溫度和酶解時間增加，抑菌率隨之先升高后降低。因此，酶解溫度和酶添加量之間存在較明顯的交互作用，酶解時間與酶添加量之間的交互作用不顯著，而酶解時間與酶解溫度存在顯著的交互作用。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過預(yù)測分析，得到最佳酶解工藝條件：酶添加量484.951 U/mL，酶解溫度44.011℃，酶解時間3.631 h，抑制率預(yù)測值為66.319%；結(jié)合實(shí)際條件，將酶解條件修正為酶添加量為485 U/mL、酶解溫度為44℃、酶解時間為3.6 h，試驗(yàn)驗(yàn)證得到實(shí)際抑制率為（68.30±3.96）%，與預(yù)測值相符。因此，該模型較好地預(yù)測了桑枝低聚糖對變異鏈球菌的抑菌率，可信度較高。

2.4 質(zhì)量濃度對桑枝低聚糖抑制變異鏈球菌生長的影響

不同質(zhì)量濃度桑枝低聚糖對變異鏈球菌的抑菌率見圖8。

圖8 不同濃度桑枝多糖對變異鏈球菌抑菌率的影響Fig.8 The effect of different concentrations of Ramulus mori polysaccharides on the inhibition rate of Streptococcus mutans

桑枝多糖與桑枝低聚糖對變異鏈球菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且濃度與其抑菌活性呈正相關(guān)，隨著濃度的升高，抑菌率也隨之升高，同質(zhì)量濃度下桑枝低聚糖的抑菌率均高于桑枝多糖。質(zhì)量濃度超過6 mg/mL后，隨著濃度的升高，抑制率趨于平緩。在適宜濃度下，多糖與低聚糖溶液濃度升高，抑菌活性物質(zhì)含量增多，對菌體細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的破壞作用越強(qiáng)，抑菌效果隨之增強(qiáng)。濃度過高，培養(yǎng)基滲透壓過高，大部分細(xì)菌均脫水死亡，抑菌率趨于100%。質(zhì)量濃度為3 mg/mL時，桑枝多糖和桑枝低聚糖對變異鏈球菌的抑菌率分別為（40.52±4.38）%和（68.91±3.82）%。結(jié)果表明采用優(yōu)化后的酶解工藝制備桑枝低聚糖，對變異鏈球菌的抑菌率提高。

2.5 桑枝低聚糖的抗氧化活性

2.5.1 清除DPPH自由基能力

不同濃度桑枝低聚糖、桑枝多糖、低聚異麥芽糖與VC標(biāo)準(zhǔn)品的DPPH自由基清除能力如圖9所示。

圖9 桑枝低聚糖的清除DPPH自由基能力Fig.9 The ability of Ramulus mori oligosaccharides to scavenge DPPH free radicals

在0.75 mg/mL～24 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，桑枝低聚糖的DPPH自由基清除能力隨著低聚糖質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，存在明顯的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，逐漸趨于平緩。桑枝低聚糖的DPPH自由基清除能力在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時達(dá)到（302.76±12.60）μg Trolox/mL。相同質(zhì)量濃度下DPPH自由基清除能力：VC>桑枝低聚糖>桑枝多糖>低聚異麥芽糖。

2.5.2 清除ABTS+自由基能力

不同濃度桑枝低聚糖、桑枝多糖、低聚異麥芽糖與VC標(biāo)準(zhǔn)品對ABTS+自由基的清除能力如圖10所示。

圖10 桑枝低聚糖的清除ABTS+自由基能力Fig.10 The ability of Ramulus mori oligosaccharides to scavenge ABTS+free radicals

在檢測濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，清除率逐漸增強(qiáng)。桑枝低聚糖的質(zhì)量濃度在12 mg/mL后清除率增加緩慢，在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時，其ABTS+自由基清除率為（5.70±0.56）mmol/L Trolox，桑枝多糖的ABTS+自由基清除率為（1.28±0.49）mmol/L Trolox，低聚異麥芽糖對ABTS+自由基的清除能力較弱，在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時，其ABTS+自由基清除率僅為（0.18±0.03）mmol/L Trolox。相同質(zhì)量濃度下 ABTS+自由基清除能力：VC>桑枝低聚糖>桑枝多糖>低聚異麥芽糖。

2.5.3 對Fe3+的還原能力

不同濃度桑枝低聚糖、桑枝多糖、低聚異麥芽糖與VC標(biāo)準(zhǔn)品對Fe3+的還原能力如圖11所示。

圖11 桑枝低聚糖的Fe3+還原能力Fig.11 The ability of Ramulus mori oligosaccharides to reduce Fe3+

在檢測濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，還原能力逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為24 mg/mL時，桑枝低聚糖的Fe3+還原能力為（63.24±3.66）mmol/L FeSO4，桑枝多糖的 Fe3+還原能力為（26.34±0.43）mmol/L FeSO4，低聚異麥芽糖對Fe3+的還原能力較弱，僅為（3.34±0.50）mmol/L FeSO4。相同質(zhì)量濃度下Fe3+的還原能力：VC>桑枝低聚糖>桑枝多糖>低聚異麥芽糖。

綜上，桑枝低聚糖對DPPH自由基、ABTS+自由基具有不同程度的清除能力，對Fe3+具有較好的還原能力。并且總抗氧化能力隨桑枝低聚糖濃度的升高而增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，較桑枝多糖有明顯提升，且強(qiáng)于低聚異麥芽糖。多糖的抗氧化活性與糖鏈上游離羥基相關(guān)，酶解后的低聚糖糖鏈縮短，暴露的游離羥基增多，可結(jié)合的自由基增多，抗氧化活性增強(qiáng)[33]。人體在新陳代謝的過程中會產(chǎn)生大量自由基，對組織細(xì)胞DNA造成損傷，誘發(fā)各種慢性疾病?？谇恢写嬖诖罅孔杂苫滓l(fā)齲齒、牙周病、咀嚼肌疾病等，清除口腔內(nèi)自由基有利于預(yù)防口腔疾病，所以桑枝低聚糖有望應(yīng)用于口腔保健用品。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化了桑枝低聚糖的酶解制備工藝。首先研究不同酶制備的桑枝低聚糖對變異鏈球菌的抑制率，再以抑菌率為指標(biāo)，考察酶添加量、酶解溫度、酶解時間對桑枝低聚糖抑菌率的影響，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化桑枝低聚糖的制備工藝，并且探究了桑枝低聚糖的抗氧化能力。得到最佳制備工藝：β-葡聚糖酶添加量為485 U/mL，酶解時間3.6 h，酶解溫度44℃，在此條件下變異鏈球菌的抑制率為（68.30±3.96）%。各因素對桑枝低聚糖抑菌率的影響程度：酶解溫度>酶解時間>酶添加量。

在此制備工藝下的桑枝低聚糖對DPPH、ABTS+自由基均有清除作用，其總抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且桑枝低聚糖的抗氧化活性均高于同質(zhì)量濃度的商品化低聚糖。本試驗(yàn)探究了桑枝低聚糖對變異鏈球菌的抑制效果，為進(jìn)一步提高蠶桑資源的綜合利用提供技術(shù)參考。