曾廣豐，謝建軍，王志元，葉遠(yuǎn)志，李 菊，侯穎燁，王 璐

（廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣州 510623）

涼茶由于具有清熱解毒、清肺潤燥解暑、提高免疫功能等功效[1]以及購買方便、易于獲取等因素，因此逐漸成為一種大眾飲品，各式各樣的涼茶種類多達(dá)500 余種。涼茶的配方與功效是立足于傳統(tǒng)中醫(yī)理論的，常與中醫(yī)中的“上火癥”相關(guān)。因此，制作涼茶經(jīng)常用到多種藥食同源的中藥材，如蒲公英、甘草、金銀花、菊花、白茅根、雞蛋花、槐花、木棉花、葛根等[2]。涼茶中的原藥材不僅種類多，使用量也非常大。現(xiàn)在的中草藥絕大部分都是人工種植，商家在人工種植過程中不可避免地使用農(nóng)藥來防治病蟲害和調(diào)節(jié)中草藥生長，最終將農(nóng)藥帶入涼茶成品中。在涼茶的原材料種植過程中使用農(nóng)藥的情況已有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]。對涼茶原料，如甘草、菊花、葛根、金銀花中農(nóng)藥殘留的測定方法[6-9]已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，然而對涼茶成品中農(nóng)藥殘留的測定方法報(bào)道較少，只有氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]。上述色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)受到分辨率、掃描速率及分析模式的限制，只能針對某一類的數(shù)種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測定，無法實(shí)現(xiàn)高通量非靶向快速篩查分析。四極桿-飛行質(zhì)譜（Q-TOF/MS）具有分析速度快、分辨率高、精確質(zhì)量數(shù)全譜采集、數(shù)據(jù)庫檢索方便等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于多農(nóng)藥殘留分析[16-22]。本文使用QuEChERS 技術(shù)提取凈化，同時(shí)結(jié)合氣相色譜-四級桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜的強(qiáng)大定性、定量功能，建立751 種農(nóng)藥篩查數(shù)據(jù)庫，以實(shí)現(xiàn)涼茶中多農(nóng)殘的非靶向快速篩查，為涼茶中農(nóng)藥殘留的檢測提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

涼茶樣品分別購于廣州市內(nèi)涼茶鋪，包括口腔茶、咽喉茶、感冒茶、止咳茶、清熱降火茶等。

20 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：γ-六六六、二嗪磷、異稻瘟凈、水胺硫磷、溴硫磷、稻豐散、殺撲磷、4，4’-滴滴伊、4，4'-滴滴滴、2，4-滴滴涕、殺螟硫磷、甲基對硫磷、甲拌磷、速滅磷、4，4’-滴滴涕、α-六六六、δ-六六六、甲氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯（德國Dr.E 標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%），購自安譜公司。用乙酸乙酯將20 種標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將20 種標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，在4 ℃下避光保存。

乙酸乙酯（色譜純級），美國賽默飛公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純級），廣州分析化學(xué)試劑廠；胺丙基粉（NH2）、石墨化碳黑（GCB）、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純級），上海安譜科技有限公司。

7890B-7200B 氣相色譜-四級桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技公司；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)，法國默克密理博公司；Heidolph multi Reax 多管渦旋振蕩器，德國海道夫集團(tuán)；3k-15/3k-14 離心機(jī)，德國西格瑪公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儀器條件

1.2.1.1 氣相色譜條件 色譜柱為DB-5 ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；載氣流速1.5 mL/min；傳輸線溫度300 ℃；程序升溫：80 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 速度升到180 ℃，保持6 min；以10 ℃/min 速度升到260 ℃，保持3 min；以20 ℃/min 速度升到300 ℃，保持8 min。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊電離（EI）源；四級桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲5 min；掃描范圍70～500 amu.；掃描速率5 張譜圖/s，高分辨率模式。

1.2.2 樣品前處理 精確稱取5.0 g 涼茶樣品至50 mL 聚丙烯塑料離心管中，加入乙酸乙酯10.0 mL，再加入3.0 g 無水硫酸鎂，0.5 g 氯化鈉，0.5 g檸檬酸鈉，0.5 g 檸檬酸氫二鈉，搖勻后，渦旋震蕩提取10 min，于10 000 r/min 離心5 min，吸取上清液1.00 mL 于裝有50 mg NH2 與100 mg GCB 的1.5 mL 離心管中，渦旋震蕩2 min，于12 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜，濾液供GC-Q-TOF/MS 測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 非靶向快速篩查非法添加物的質(zhì)控方法

為保證樣品前處理過程、整個(gè)色譜保留時(shí)間和高分辨質(zhì)量數(shù)的精確度和準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，挑選20 種農(nóng)藥進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)，進(jìn)行定量分析。選擇的農(nóng)藥包括有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯等極性跨度大和出峰時(shí)間分散的化合物，能夠有效監(jiān)控非靶向篩查過程中整體試驗(yàn)條件的穩(wěn)定性，確保篩查結(jié)果穩(wěn)定可靠。2.2～2.6 節(jié)為優(yōu)化前處理過程，本研究挑選其中10 個(gè)代表性化合物分別在2.2 節(jié)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化前處理和儀器檢測條件。

2.2 凈化劑種類的選擇

QuEChERS 方法中常見的凈化劑有NH2、GCB、硅膠鍵合碳十八 （C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、硅膠（Silica）、堿性氧化鋁（Al-B）、中性氧化鋁 （Al-N） 以及目前新型的碳納米凈化粉（NANO）。本試驗(yàn)考察了這8 種凈化劑在相同劑量下的凈化效果，結(jié)果見圖1。

圖1 8 種凈化劑處理后10 種質(zhì)控農(nóng)藥的回收率Fig.1 Recovery of 10 quality control pesticides cleaned by 8 kinds of absorbents

凈化劑用量均為100 mg，標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加量為100 μg/kg。使用Al-B 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率在77.4%～119.4%之間；PSA 能有效除去基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素和糖類物質(zhì)，使用PSA 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率在82.9%～101.2%之間；使用AL-N 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為88.8%～102.7%；C18 對非極性組分有吸附作用，使用C18 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為87.0%～100.3%；GCB 主要吸附一些平面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如植物色素，使用GCB 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為95.3%～112.6%；使用NANO 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率在74.0%～100.7%之間；使用硅膠作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率介于91.5～101.3%；使用NH2作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為98.2%～118.7%。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析對比，并綜合考慮各種凈化劑的凈化效果及對多類別、多種農(nóng)藥的吸附，因此最后選用NH2 和GCB 作為凈化劑。

2.3 凈化劑用量的選擇

經(jīng)2.2 節(jié)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析確定了合適的凈化劑種類為GCB 和NH2。為了進(jìn)一步研究凈化劑的最佳用量，分別考察凈化劑GCB 和NH2 在30，50，70，90，110 mg 5 個(gè)用量水平上的凈化效果，通過回收率確定最佳用量，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，GCB 用量在90 mg 和110 mg 之間回收率達(dá)到最佳；以50 mg NH2 作為凈化劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率總體效果較好，故決定選用50 mg NH2 與100 mg GCB 作為本試驗(yàn)的凈化劑組合。

圖2 GCB 和NH2 用量對10 種質(zhì)控農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effects of dosage of GCB and NH2 on recovery of 10 quality control pesticides

2.4 提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)考察了乙酸乙酯、正己烷、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷5 種溶劑的提取效果，結(jié)果見圖3。使用乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為84.4%～111.6%，總體回收率較好；使用乙腈作為提取溶劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為20.5%～65.7%，各質(zhì)控化合物回收率均較差，且部分質(zhì)控化合物回收率顯著偏低，故乙腈不宜作為本試驗(yàn)的提取溶劑；使用正己烷作為提取溶劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為30.0%～136.1%，各質(zhì)控化合物回收率波動較大，部分化合物回收率太低；使用二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，回收率在96.6%～261.6%之間，部分質(zhì)控化合物回收率偏高；使用三氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率介于86.9%～157.1%之間，部分化合物回收率偏高。兼顧10 種質(zhì)控化合物的回收率，決定選用乙酸乙酯作為本試驗(yàn)的提取溶劑。

圖3 提取溶劑對10 種質(zhì)控農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 Effects of extracted solvents on recovery of 10 quality control pesticides

2.5 提取方式和時(shí)間的選擇

本試驗(yàn)對渦旋、超聲、搖床3 種提取方式提取效果進(jìn)行了考察，使用10 種質(zhì)控農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)添加量（100 μg/kg）進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。采用搖床提取方式時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為86.3%～123.1%；采用超聲提取法時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率介于81.9%～159.6%；采用渦旋提取時(shí)，各質(zhì)控化合物回收率為88.0%～108.0%。兼顧各質(zhì)控化合物的回收率，采用渦旋提取法時(shí)，回收率更集中，故采用渦旋提取法作為提取方式。同時(shí)探究了渦旋提取5，10，15，20，25 min 的提取效果。結(jié)果表明：提取時(shí)間為10 min 時(shí)回收率介于92.0%～100.7%之間，10 種質(zhì)控農(nóng)藥是總體回收率都較好，可以滿足方法學(xué)的要求，故決定采用10 min 作為本試驗(yàn)的提取時(shí)間。

圖4 不同提取方式對10 種質(zhì)控農(nóng)藥回收率的影響Fig.4 Effects of different extracted methods on recovery of 10 quality control pesticides

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)常常顯著干擾儀器分析時(shí)的分析過程，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾即為基質(zhì)效應(yīng)。本試驗(yàn)分別用乙酸乙酯和空白涼茶樣品提取的基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對添加標(biāo)準(zhǔn)含量為100 μg/kg 的樣品分別進(jìn)行定量分析并計(jì)算回收率，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙酸乙酯配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析10 種質(zhì)控農(nóng)藥中甲氰菊酯的定量明顯偏低，只有14.88%；甲拌磷的定量明顯偏高達(dá)到136.89%；高效氟氯菊酯和4，4’-DDT 出現(xiàn)抑制效應(yīng)回收率分別是72.15%，83.89%；空白涼茶樣品提取的基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量涼茶提取液配制的10 種質(zhì)控農(nóng)藥的回收率都介于85.0%～102%之間。因此，本試驗(yàn)采用空白涼茶提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到消除基質(zhì)效應(yīng)的目的。

圖5 10 種質(zhì)控農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.5 Matrix effects of 10 quality control pesticides

2.7 方法定性定量、回收率與精密度

按照優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件處理空白涼茶基質(zhì)，得到相應(yīng)基質(zhì)的空白基質(zhì)液，將配得的基質(zhì)曲線（5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 μg/L）在1.2.1節(jié)的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，20 種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖6。以定量離子的峰面積y 對進(jìn)樣質(zhì)量濃度x（μg/L）進(jìn)行線性回歸，20 種質(zhì)控農(nóng)藥的定性定量離子、保留時(shí)間、線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明，20 種化合物的響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9907。

表1 20 種化合物的定性、定量信息Table 1 Qualitative and quantitative information of 20 compounds

（續(xù)表1）

圖6 20 種質(zhì)控化合物的總離子流色譜圖Fig.6 Total ions chromatogram of 20 controlled compounds

方法的回收率與精密度試驗(yàn)采用空白基質(zhì)加標(biāo)25，50，125 μg/kg 3 個(gè)水平，同時(shí)測定6 組平行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，在上述試驗(yàn)條件下，20 種質(zhì)控化合物農(nóng)藥回收率介于73.47%～106.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.91%～9.11%，回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求。分別按3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），20 種化合物 的LOD 為2.00～50.0 μg/kg，LOQ 為5.00～150 μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

表2 20 種化合物的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）Table 2 The recovery and precisions of 20 compounds （n=6）

2.8 非靶向篩查方法建立

基于2.7 節(jié)的方法驗(yàn)證結(jié)果可知，本方法的準(zhǔn)確度與精密度好，可擴(kuò)展到?jīng)霾柚卸噢r(nóng)殘的非靶向篩查。樣品經(jīng)前處理后供GC-Q-TOF 測定采集高分辨質(zhì)譜信息。高分辨數(shù)據(jù)庫是實(shí)現(xiàn)非靶向篩查的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)應(yīng)用安捷倫的Mass Hunter Qualitative Analysis B07.00 軟件進(jìn)行化合物信息數(shù)據(jù)存儲以及歸類，將751 種農(nóng)藥的譜圖信息導(dǎo)入軟件構(gòu)成涼茶中751 種農(nóng)藥的高分辨篩查數(shù)據(jù)。篩查流程如圖7所示，以α-HCH 為例闡述涼茶中多農(nóng)殘的非靶向篩查方法如下：先進(jìn)行一級全掃描，采集結(jié)果提取一級精確質(zhì)量與已建立的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配分析。對一級精確質(zhì)量相匹配的目標(biāo)峰進(jìn)行碎片豐度比匹配，豐度前三的二級碎片豐度比偏差小于20%可判定為檢出。檢索條件設(shè)置如下：精確質(zhì)量數(shù)提取誤差±10×10-6，定性軟件根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥的精確質(zhì)量、相對豐度比等要素與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行精確匹配，對檢索得分≥80，為疑似陽性檢出。同時(shí)為避免假陽性結(jié)果，篩查出的疑似農(nóng)藥還需進(jìn)行二級子離子信息確證。本方法對二級碎片的基峰同位素分布和精確質(zhì)量數(shù)等信息進(jìn)行匹配。如碎片精確質(zhì)量數(shù)偏差在±10×10-6以內(nèi)，碎片基峰同位素豐度比偏差小于20%可判定為檢出。本文所建立涼茶中的非法添加物非靶向篩查技術(shù)完全滿足方法學(xué)要求。

圖7 非靶向篩查圖示（α-六六六）Fig.7 Diagram of non-target screening （α-HCH）

2.9 實(shí)際樣品分析

采取1.2 節(jié)建立的篩查方法對購自廣州市多間涼茶鋪的36 份散裝涼茶樣品進(jìn)行751 種農(nóng)藥殘留的篩查測定。共有3 個(gè)樣品檢測出呋草黃，含量范圍為124～633 μg/kg。1 個(gè)樣品檢出聯(lián)苯菊酯，含量為367 μg/kg。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化QuEChERS 方法，結(jié)合高分辨質(zhì)譜建立了涼茶中751 種農(nóng)藥殘留非靶向篩查方法。本方法操作簡單，可以顯著降低基質(zhì)干擾，提高凈化效率，具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可篩查物質(zhì)譜廣，可對市售涼茶中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行非靶向快速篩查。由于涼茶配方眾多，熬制涼茶的原料來源渠道參差不齊，而消費(fèi)者一次服用量比較大，對涼茶的農(nóng)殘風(fēng)險(xiǎn)檢測是必不可少的。本方法的建立為涼茶中多農(nóng)殘篩查提供了一個(gè)新的思路，可保證涼茶飲料的質(zhì)量安全，助力我國涼茶行業(yè)的健康有序發(fā)展。