司 睿，吳廣培，王 鋒，雷紅濤，王 弘

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室畜產(chǎn)品精準(zhǔn)加工與安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心（廣東） 廣州 510642）

微囊藻毒素（Microcysin，MC）是一種天然小分子毒素[1]，由藍(lán)藻產(chǎn)生并釋放到水體中[2]，主要有MC-LR、MC-LA、MC-LY、MC-LW、MC-LF、MCYR、MC-WR、MC-RR 等8 種異構(gòu)體[3]，其中MCLR 毒性最強(qiáng)[4]，普通水廠凈化不能有效去除，嚴(yán)重威脅人畜飲用水安全。1996年，巴西一透析中心的透析液被MC-LR 污染，導(dǎo)致至少26 人死亡[5]。而在我國(guó)，2007年太湖藍(lán)藻爆發(fā)導(dǎo)致整個(gè)無錫市的飲用水污染[6]。此外，在長(zhǎng)江、黃河、松花江中下游等主要河流以及鄱陽湖、武漢東湖、上海淀山湖等幾大淡水湖泊中，均檢測(cè)到MC-LR。構(gòu)建藻毒素的快速檢測(cè)方法十分必要。

免疫分析方法是一種基于抗原與抗體特異性識(shí)別的檢測(cè)技術(shù)[7]，由于特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)分析中[8-9]。近年來，免疫分析方法發(fā)展迅速，其中以酶聯(lián)免疫分析法 （Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 應(yīng)用最廣泛[10]。對(duì)于免疫分析方法而言，制備高質(zhì)量的抗體是其重點(diǎn)與難點(diǎn)所在[11]。與傳統(tǒng)多克隆抗體和單克隆抗體相比，僅由重鏈可變區(qū)組成的納米抗體（Nanobody，Nb）具有穩(wěn)定性強(qiáng)、易表達(dá)、易于基因工程操作等特性[12-13]，在免疫檢測(cè)方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)越來越受到人們的關(guān)注。本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建好的噬菌體展示納米抗體文庫[14]，采用固相親和淘篩的方法，制備得到特異性識(shí)別MC-LR 的納米抗體，建立MC-LR 的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品中MC-LR 的檢測(cè)。

圖1 微囊藻毒素-LR 結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of MC-LR

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MCs 標(biāo)準(zhǔn)品，臺(tái)灣Algal 公司；大腸桿菌BL21（DE3）菌株，全式金生物公司；大腸桿菌ER2738菌株，美國(guó)Lucigen 公司；TMB 顯色液，北京索萊寶科技有限公司；兔抗VHH-HRP 多克隆抗體，南京金斯瑞科技有限公司；輔助噬菌體M13K07，NEB 生物科技有限公司；M13 噬菌體抗體，美國(guó)GE 公司；引物合成及測(cè)序由廣州睿博公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop 2000C 分光光度計(jì)、SORVALL LYNX 4000 centrifuge 離心機(jī)、Multiskan MK3 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；蛋白電泳儀、Biologic LP蛋白純化儀、GDS7500 凝膠成像儀，美國(guó)BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體展示納米抗體文庫的篩選與鑒定采用固相親和淘篩方法，對(duì)已構(gòu)建好的納米抗體文庫進(jìn)行4 輪篩選，每輪包被不同質(zhì)量濃度微囊藻毒素-雞蛋白蛋白偶聯(lián)物MC-LR-OVA（10，2.5，0.5，0.1 μg/mL），37 ℃包被過夜。用磷酸鹽緩沖液（吐溫）洗滌2 次，每輪選用不同封閉液封閉3 h。將100 μL 納米抗體文庫加入包被原孔，37 ℃振蕩孵育1 h。第1～3 輪淘篩加入藥物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫，質(zhì)量濃度依次為2，0.5，0.1 μg/mL，第4 輪為10 mg/mL 胰蛋白酶，37 ℃振蕩1 h，重復(fù)洗脫1次，混合兩次洗脫液即為各輪淘篩產(chǎn)物。取10 μL洗脫液計(jì)算滴度，其余進(jìn)行擴(kuò)增后用于下一輪的淘篩。從第4 輪的平板上隨機(jī)挑取20 個(gè)單克隆進(jìn)行深孔板表達(dá)，用ic-ELISA 方法檢測(cè)其活性。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，抑制率（Inhibition rate，I）計(jì)算公式如下：

式中，B0——MC-LR“0”質(zhì)量濃度孔對(duì)應(yīng)的吸光值；B——MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)溶液孔對(duì)應(yīng)的吸光值。

1.3.2 抗MC-LR 納米抗體的表達(dá)純化與性能分析 將含有抗 MC-LR 納米抗體基因的pComb3XSS 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21（DE3） 中，表達(dá)條件為：37 ℃、250 r/min、1%接種量、0.1 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，采用凍融法提取菌體周質(zhì)腔，經(jīng)鎳柱親和純化獲得納米抗體。利用ic-ELISA 方法，研究其熱穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑耐受性。

1.3.3 基于抗MC-LR 納米抗體M110 的ic-ELISA 的方法建立 用包被液將包被抗原MCLR-OVA 稀釋至1 000 ng/mL，100 μL/孔加入到酶標(biāo)板，37 ℃包被過夜。次日，用1%魚膠，37 ℃封閉3 h。向酶標(biāo)板內(nèi)加入50 μL/孔的納米抗體及50 μL/孔不同質(zhì)量濃度的MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，37 ℃孵育40 min。用PBST 洗滌5 次，加入100 μL/孔的兔抗VHH-HRP 抗體（0.1 μg/mL），37 ℃孵育40 min。用PBST 洗滌5 次后，加入100 μL/孔的TMB顯色液，37 ℃孵育10 min，加入50 μL/孔10%的H2SO4溶液終止后，測(cè)定A450nm吸光值。

1.3.4 樣品添加回收及方法準(zhǔn)確性分析 取車陂涌華南農(nóng)業(yè)大學(xué)段水樣，參照國(guó)標(biāo)GB/T 20466-2006《水中微囊藻毒素的測(cè)定》的檢測(cè)方法，以建立的ic-ELISA 方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與UPLCMS/MS 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，評(píng)價(jià)方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體展示納米抗體文庫的淘篩

以MC-LR 為免疫原，本課題組在試驗(yàn)前期已成功構(gòu)建庫容量為8.33×107CFU/mL VHH 基因文庫。經(jīng)輔助噬菌體M13K07 救援后，獲得滴度為1.0×1012PFU/mL 噬菌體展示納米抗體文庫。

以MC-LR-OVA 為包被原，對(duì)噬菌體展示納米抗體文庫進(jìn)行4 輪淘篩，從第4 輪篩選的洗脫產(chǎn)物測(cè)定平板上隨機(jī)挑選20 個(gè)克隆，用ic-ELISA鑒定其活性，結(jié)果如圖2所示。最終獲得抗MCLR 納米抗體2 株：M110 和M207，其序列信息如圖3所示。采用ic-ELISA 檢測(cè)抗體活性，選擇抑特異性較好的M110 克隆（I=97.26%）用于后續(xù)研究。

圖2 ic-ELISA 鑒定特異性陽性克隆Fig.2 Identification of specific positive clones by ic-ELISA

圖3 M110、M207 序列比對(duì)Fig.3 Sequence aligment of M110 and M207

2.2 納米抗體M110 的表達(dá)純化及性能分析

表達(dá)純化后的納米抗體經(jīng)SDS-PAGE 和免疫印跡驗(yàn)證（圖4），純度可達(dá)90%以上，表達(dá)量為3.5 mg/L。穩(wěn)定性分析結(jié)果表明（圖5），納米抗體M110 在90 ℃孵育1 h，仍具備超過60%的抗原結(jié)合活性，且在體積分?jǐn)?shù)40%甲醇或乙腈中仍具有超過80%的活性，這顯示該抗體具有較好的熱穩(wěn)定和有機(jī)溶劑耐受性。

圖4 SDS-PAGE（a）和免疫印跡（b）驗(yàn)證純化后納米抗體M110Fig.4 Identification of the purified nanobody M110 by SDS-PAGE （a） and western blotting （b）

圖5 納米抗體M110 熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性分析Fig.5 Thermal stability and organic solvents tolerance of nanobody M110

2.3 基于納米抗體M110 的ic-ELISA 方法建立及靈敏度和特異性評(píng)價(jià)

2.3.1 基于納米抗體M110 的ic-ELISA 方法建立 建立基于納米抗體M110 檢測(cè)MC-LR 的ic-ELISA 方法，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。如圖6所示，其IC50為3.55 ng/mL，線性范圍為1.28～9.88 ng/mL，檢測(cè)限為0.652 ng/mL，其與所有藻毒素類毒素均有交叉（表1），可能的原因是藻毒素均有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域Adda，納米抗體M110 能夠識(shí)別的區(qū)域是Adda。

表1 納米抗體M110 與藻毒素的交叉率（n=3）Table 1 The crossover rate between nanobody M110 and algal toxin （n=3）

圖6 基于納米抗體M110 的ic-ELISA 方法檢測(cè)MC-LR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）Fig.6 The standard curve of ic-ELISA for detecting MC-LR based on nanobody M110 （n=3）

2.3.2 樣品添加回收及方法準(zhǔn)確性分析 分別對(duì)水樣添加不同質(zhì)量濃度MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品（0.5，1，2 ng/mL）進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，采用UPLC-MS/MS 方法對(duì)ic-ELISA 方法進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果見表2，ic-ELISA 方法回收率為111.0%～119.3%，從圖7中可以看出，兩種方法的結(jié)果相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999，結(jié)果表明ic-ELISA 方法檢測(cè)準(zhǔn)確性良好。

表2 基于M110 的ic-ELISA 方法檢測(cè)水樣中MC-LR 的回收率（n=3）Table 2 Recovery of MC-LR in water samples detected by ic-ELISA based on M110 （n=3）

圖7 ic-ELISA 和UPLC-MS/MS 方法檢測(cè)水樣中MC-LR 的結(jié)果比對(duì)（n=3）Fig.7 Results comparison of MC-LR in water samples detected by ic-ELISA and UPLC-MS/MS （n=3）

3 結(jié)論

納米抗體因其特性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療方面，近年來也被廣泛應(yīng)用于小分子污染物檢測(cè)中。本研究構(gòu)建了針對(duì)MC-LR 的納米抗體文庫，庫容量為8.33×107CFU/mL。并通過親和淘篩獲得MCLR 納米抗體M110，建立了MC-LR 的ic-ELISA方法，其IC50為3.55 ng/mL。將該方法其應(yīng)用于水樣中MC-LR 的檢測(cè)，并利用UPLC-MS/MS 方法進(jìn)行儀器比對(duì)，該ic-ELISA 方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高，制備的納米抗體M110 還具有較好的熱穩(wěn)定性與有機(jī)溶劑耐受性，可用于免疫快速檢測(cè)試劑盒的開發(fā)研究。