黃 珂，許克靜，陳 康，梁 淼，楊金初，張峻松*

（1 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 鄭州 450001 2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 鄭州 450001）

柑橘（Citrus reticulata Blanco），屬蕓香科類植物[1]，是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值[2]，被廣泛應(yīng)用于食品、香料、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域[3-4]。其主要成分為檸檬烯[5-7]，具有抗菌、抗氧化、抗癌、止咳平喘和抗炎等生理功能[8-10]，對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等均具有抑制作用，并能減輕各種癌癥帶來的損傷[11]。目前關(guān)于柑橘的研究也主要集中在柑橘精油提取、成分鑒定及功效分析等方面[12-17]，而對于橘皮中檸檬烯的釋放行為的研究關(guān)注較少。橘皮中的檸檬烯不穩(wěn)定[18-19]，揮發(fā)性強(qiáng)，釋放較快，且釋放行為易受外界條件（如光熱）的影響，這些性質(zhì)制約了其終端產(chǎn)品的應(yīng)用。掌握橘皮中的特征香氣成分釋放行為，對于基于橘皮的產(chǎn)品加工與利用具有重要。

本文以橘皮為研究對象，采用吹掃捕集-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（P＆T-GC/MS）聯(lián)用技術(shù)建立橘皮中檸檬烯含量分析方法，研究檸檬烯的釋放行為，以及外界條件（溫度、時(shí)間）對釋放行為的影響。采用動力學(xué)方程對釋放行為進(jìn)行擬合，獲得動力學(xué)模型，以控制橘皮特征香味成分的釋放，并為拓寬其應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

柑橘，江西贛南；檸檬烯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），百靈威科技有限公司。

SB-3200DT 超聲萃取儀，寧波新芝生物科技有限公司；7890B/5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；EL204 電子天平，Mettler-Toledo 儀器（上海）有限公司；EL204 吹掃捕集儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 稱取檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品0.03 g（精確至0.1 mg）于100 mL 容量瓶中，用水溶液定容刻度，得到檸檬烯質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液10，20，30，40，50，60，80，100 μL 于100 mL 容量瓶中，加入水溶液定容刻度，得到質(zhì)量濃度為0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18，0.2，0.3 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 吹掃捕集分析條件 吹掃捕集條件：吹掃氣：高純N2（純度99.999%），吹掃流量40 mL/min；吹掃溫度：70 ℃；吹掃時(shí)間：7 min；干吹時(shí)間：0.25 min；吹掃時(shí)捕集阱的溫度：室溫；解吸溫度：250℃；解吸時(shí)間：2 min；烘焙溫度：260 ℃；烘焙時(shí)間：2 min。

1.2.3 GC-MS 分析條件 色譜柱：HP-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；分流比：5∶1；載氣：He；流速：1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度：40 ℃（10 min），4 ℃/min 升到250 ℃（20 min）。

電子轟擊離子源（EI）源電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃，傳輸線溫度：280 ℃，溶劑延遲：4.50 min。

1.2.4 樣品前處理 將新鮮的柑橘用清水洗凈，瀝干，剝離柑橘果皮。將果皮放入烘箱中，溫度45℃條件下熱風(fēng)干燥12 h，粉碎機(jī)粉碎，過篩得到40～60 目橘皮粉。準(zhǔn)確稱取0.03 g 橘皮粉置于500 mL 錐形瓶中，加入500 mL 純凈水，超聲萃取30 min，用移液管移取10 mL 萃取液，迅速裝入40 mL 吹掃捕集管中，然后裝載到吹掃捕集儀中進(jìn)行吹掃捕集-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.2.5 不同溫度下橘皮中檸檬烯釋放 以橘皮為研究對象，按1.2.4 節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，設(shè)置9 個(gè)吹掃溫度：40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃，每隔1 min（共65 min）記錄捕集管中特征成分的釋放情況。

1.2.5.1 釋放量計(jì)算 根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中檸檬烯的釋放量H：

式中，Hn——前n min 檸檬烯釋放量，mg/g；m1——第1 分鐘檸檬烯檢測值，mg/g；mn——第n分鐘檸檬烯檢測值，mg/g。

1.2.5.2 釋放率計(jì)算 根據(jù)公式（2）計(jì)算檸檬烯在樣品中檸檬烯的釋放率Q：

式中，Qn——前n min 檸檬烯釋放率，%；Hn——前n min 檸檬烯釋放量，mg/g；H65——65 min 內(nèi)檸檬烯釋放量，mg/g。

1.2.5.3 檸檬烯釋放行為動力學(xué)擬合 利用藥物緩釋動力學(xué)模型，對橘皮檸檬烯的釋放行為進(jìn)行動力學(xué)分析。常用的緩釋模型有零級模型[20-21]、一級模型[22]和Higuchi 模型[23]。

式中，Q——樣品中檸檬烯的釋放率，%；t——橘皮的釋放時(shí)間，min；k——釋放速率常數(shù)；a——公式參數(shù)。

據(jù)上述零級模型、一級模型、Higuchi 模型對樣品中檸檬烯的釋放行為進(jìn)行擬合分析，獲得可較好描述釋放行為的動力學(xué)模型，分析樣品中檸檬烯在不同溫度下的釋放規(guī)律。同時(shí)利用阿倫尼烏斯公式（式6）計(jì)算反應(yīng)活化能。

式中，k——溫度T 時(shí)的釋放速度常數(shù)；Ea——活化能，kJ/mol；T——絕對溫度，K；R——摩爾氣體常數(shù)，J/（mol·K）；A——指前因子。

以lnk 為縱坐標(biāo)，1/T 為橫坐標(biāo)作圖，通過直線的斜率（-Ea/R）計(jì)算反應(yīng)活化能Ea，截距計(jì)算指前因子A。

1.2.5.4 半衰期的計(jì)算 檸檬烯釋放一半時(shí)所需時(shí)間稱為半衰期（T），由式（7）可得，一級反應(yīng)的半衰期[24]為：

式中，T——橘皮的半衰期，min；k——釋放速率常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 橘皮中香味成分分析

用P＆T-GC-MS 分析橘皮香味成分，檢測結(jié)果總離子流圖見圖1，分析結(jié)果見表1。橘皮中主要香味成分為檸檬烯，占香味成分總量的95.01%。后續(xù)將檸檬烯作為橘皮的特征香味成分，對其釋放行為進(jìn)行研究。

表1 橘皮中香味成分分析結(jié)果Table 1 Analysis results of aroma components in orange peel

圖1 橘皮中香味成分的總離子流圖Fig.1 A total ion flow map of the scented ingredients in orange peel

2.2 吹掃捕集參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 吹掃流量 吹掃流量是P＆T-GC/MS 分析方法的關(guān)鍵因素，影響色譜峰的分離度、峰形以及捕集效率[25]。考察不同吹掃流量（10，20，30，40，50，60，70，80，90 mL/min）對樣品中檸檬烯釋放量的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)吹掃流量為40 mL/min 時(shí)，檸檬烯的釋放量最高。最終選定吹掃流量為40 mL/min。

圖2 吹掃流量對樣品中檸檬烯釋放量的影響Fig.2 The effect of purging flow on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.2 解吸時(shí)間 通過改變解吸時(shí)間，確保各目標(biāo)物質(zhì)完全解吸進(jìn)入色譜柱。分別設(shè)置解吸時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 min，考察不同解吸時(shí)間對樣品中檸檬烯釋放量的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)解吸時(shí)間為2 min 時(shí)，檸檬烯的釋放量最大，說明檸檬烯的解吸較完全。最終選定解吸時(shí)間為2 min。

圖3 解吸時(shí)間對樣品中檸檬烯釋放量的影響Fig.3 The effect of desorption time on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.3 解吸溫度 快速升溫和重復(fù)性好的解吸溫度是P＆T-GC/MS 分析方法的關(guān)鍵，影響方法的準(zhǔn)確度和精密度[26]?？疾觳煌馕鼫囟龋?10，220，230，240，250，260 ℃）對樣品中檸檬烯釋放量的影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)解吸溫度為250 ℃時(shí)，檸檬烯的釋放量最大，繼續(xù)增大解吸溫度，檸檬烯釋放量會有所下降?？赡茉蚴墙馕鼫囟冗^高，導(dǎo)致吸附劑自身分解，縮短吸附劑的使用壽命。最終選定解吸溫度為250 ℃。

圖4 解吸溫度對樣品中檸檬烯釋放量的影響Fig.4 The effect of desorption temperature on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.4 吹掃時(shí)間 吹掃時(shí)間直接影響目標(biāo)化合物的回收率[27]。考察不同吹掃時(shí)間（1～16 min）對樣品中檸檬烯釋放量的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)吹掃時(shí)間為7 min 時(shí)，檸檬烯的釋放量最大，繼續(xù)增大吹掃時(shí)間，檸檬烯釋放量趨于平穩(wěn)，說明吹掃時(shí)間7 min 時(shí)，檸檬烯的吹掃完全。最終選定吹掃時(shí)間為7 min。

圖5 吹掃時(shí)間對樣品中檸檬烯釋放量的影響Fig.5 The effect of purging time on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.5 吹掃溫度 吹掃溫度是影響檢測效果的重要因素，如選擇不合適，靈敏度和準(zhǔn)確度會降低，分析時(shí)間變長，且不能將多種揮發(fā)性有機(jī)物完全分離[27]?？疾觳煌祾邷囟龋?0，50，60，70，80 ℃）對樣品中檸檬烯釋放量的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)吹掃溫度為70 ℃時(shí)，檸檬烯的釋放量最大。最終選定吹掃溫度為70 ℃。

圖6 吹掃溫度對樣品中檸檬烯釋放量的影響Fig.6 The effect of purging temperature on the release content of limonene in tangerine peel

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 分別取系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行P＆T-GC/MS 分析，以橫坐標(biāo)為檸檬烯峰面積，縱坐標(biāo)為檸檬烯的質(zhì)量濃度，作檸檬烯的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見表2。檸檬烯在0.06～0.30 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍線性良好（R2≥0.9904），檢出限為0.020 μg/mL。

表2 檸檬烯的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit of limonene

2.3.2 加標(biāo)回收率與精密度 在橘皮中添加已知量的檸檬烯溶液，按照1.2.3 節(jié)和1.2.4 節(jié)的方法測定，平行測定5 次。如表3所示，樣品中檸檬烯的平均回收率在96.97%～126.71%之間，精密度1.19%～4.70%（n=5），表明所建方法回收率較高，精密度良好，重復(fù)性好，可用于樣品中檸檬烯釋放量的測定。

表3 檸檬烯的回收率與精密度Table 3 Recovery and precision of limonene

2.4 不同溫度下樣品中檸檬烯釋放行為分析

2.4.1 溫度對樣品中檸檬烯釋放行為的影響 吹掃溫度是影響檸檬烯釋放量的重要因素，考察不同吹掃溫度（40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃）下樣品中檸檬烯的釋放量隨吹掃時(shí)間 （時(shí)間間隔5 min）的變化，結(jié)果如圖7a所示。圖7b 為前30 min內(nèi)每隔5 min 檸檬烯釋放增量，即檸檬烯釋放的增速。可見，隨著釋放時(shí)間的增加，樣品中檸檬烯釋放量呈先快速增加后緩慢增加的趨勢。0～10 min，樣品中檸檬烯釋放量快速增加，在設(shè)定溫度范圍隨溫度的增加，釋放量在1.59～2.17 mg/g 范圍呈升高趨勢。吹掃溫度越高，檸檬烯釋放速率越快，這是由于環(huán)境溫度升高，促進(jìn)了檸檬烯分子的布朗運(yùn)動，使檸檬烯釋放的動能增大，釋放速率加大。

圖7 不同溫度下樣品中檸檬烯的釋放量（a）及曲線斜率（b）Fig.7 Release content （a） and curve slope （b） of limonene in samples at different temperatures

10～20 min 內(nèi)，樣品中檸檬烯釋放量增加的趨勢減緩，對應(yīng)釋放量為0.20～0.66 mg/g。同時(shí)，該時(shí)間段檸檬烯釋放速率明顯降低，且隨吹掃溫度的提高，檸檬烯釋放速率反而呈降低趨勢。這可能是由于高溫吹掃條件下，前10 min 內(nèi)檸檬烯大量釋放，使樣品中檸檬烯含量過低所致。20～30 min，檸檬烯釋放量由緩慢增加趨勢逐漸過渡到基本持平，相應(yīng)釋放量為0.06～0.15 mg/g，表明前20 min內(nèi)樣品中檸檬烯基本完全釋放。

計(jì)算各時(shí)間間隔下，樣品中檸檬烯的釋放率隨溫度的變化，結(jié)果見表4和圖8。0～20 min，隨吹掃溫度的增加，檸檬烯釋放率逐漸增大。例如：吹掃時(shí)間為5 min 時(shí)，吹掃溫度從40 ℃增至80 ℃，釋放率從28.93%增至72.10%。20～65 min，隨吹掃溫度增加，檸檬烯釋放率緩慢增加，是由于是前20 min 樣品中檸檬烯基本釋放，檸檬烯質(zhì)量濃度過低所致。另外，隨著吹掃溫度的提高，達(dá)到相同釋放率的時(shí)間縮短。例如，檸檬烯釋放率在80%以上，40～50 ℃時(shí)需15 min，55～80 ℃時(shí)需10 min；檸檬烯釋放率在90%以上，40～50 ℃時(shí)需20～25 min，55～80 ℃時(shí)需15～20 min。

圖8 不同吹掃溫度下樣品中檸檬烯的釋放率Fig.8 Release rate of limonene in samples at different purging temperatures

表4 不同吹掃溫度下樣品中檸檬烯的釋放率Table 4 Release rate of limonene in samples at different purging temperatures

2.4.2 不同溫度下樣品中檸檬烯釋放動力學(xué)行為 采用藥物釋放的動力學(xué)方程：零級釋放、一級釋放、Higuchi 模型，對不同溫度下樣品中檸檬烯的釋放過程進(jìn)行擬合，比較不同動力學(xué)方程擬合的相關(guān)系數(shù)R2值，結(jié)果見表5。釋放過程對不同模型的擬合度有一定差異，其中一級釋放擬合效果最好，R2值最大，為0.906～0.997。這表明樣品中的檸檬烯質(zhì)量濃度對釋放速率起關(guān)鍵性作用，是吹掃過程中釋放的驅(qū)動力。

表5 各釋放動力學(xué)方程對橘皮釋放行為的釋放擬合Table 5 The release fitting of each release kinetic equation to the release behavior of tangerine peel

對不同溫度下檸檬烯的釋放過程進(jìn)行一級釋放動力學(xué)擬合，結(jié)果如圖9所示。計(jì)算不同溫度下釋放的半衰期，結(jié)果如表6所示。檸檬烯的釋放速率常數(shù)和半衰期與吹掃溫度關(guān)系密切，其中釋放速率常數(shù)隨溫度的升高而增大，表明檸檬烯釋放行為對溫度敏感，溫度越高，釋放速度越快。同時(shí)，隨著溫度的上升，檸檬烯的半衰期逐漸變短。半衰期表明釋放量達(dá)到一半時(shí)對應(yīng)的時(shí)間。40 ℃時(shí)檸檬烯半衰期約為7.33 min，明顯大于80 ℃時(shí)的半衰期（約2.22 min）。

表6 一級擬合下不同溫度下橘皮微粉中檸檬烯釋放的半衰期Table 6 The half-life of limonene released from orange peel micropowder at different temperatures under the first-order fitting

圖9 一級釋放模型擬合不同溫度下樣品中檸檬烯的釋放Fig.9 The first-order release model fits the release of limonene in samples at different temperatures

活化能Ea是指在化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)物達(dá)到活化分子所需的最小能量[28]。采用阿倫尼烏斯公式計(jì)算反應(yīng)活化能，以lnk 為縱坐標(biāo)，1/T 為橫坐標(biāo)作圖。通過直線的斜率（-Ea/R）、截距（ln A）計(jì)算反應(yīng)活化能Ea、指前因子A。結(jié)果見表7所示。從樣品中釋放檸檬烯的活化能為31.71 kJ/mol，指前因子為1.66×104。徐明月等[29-30]研究指出柑橘皮在不同干燥條件下活化能范圍為10.39～28.10 kJ/mol，檸檬烯釋放的活化能稍高于橘皮的干燥活化能，表明檸檬烯釋放所需能量高于干燥能量。

圖10 樣品中檸檬烯釋放率的lnk 對1/T 的線性擬合Fig.10 Linear fitting of lnk to 1/T of the release rate of limonene in the sample

表7 樣品中檸檬烯釋放的動力學(xué)參數(shù)Table 7 Kinetic parameters of the release of limonene in the sample

3 結(jié)論

利用P T-GC/MS 建立了樣品中檸檬烯含量的檢測方法?；谠摲椒疾觳煌瑴囟葪l件下檸檬烯的釋放行為，并用釋放動力學(xué)方程對橘皮釋放進(jìn)行擬合，獲得合適的動力學(xué)模型。結(jié)果表明：1）基于P＆T-GC/MS 聯(lián)用技術(shù)的測定方法在0.06～0.30 μg/mL 范圍線性良好，檢出限為0.020 μg/mL，檸檬烯回收率96.97%～126.71%，精密度為1.19%～4.70%（n=5）。2）各試驗(yàn)溫度下，隨著釋放時(shí)間的增加，樣品中檸檬烯含量呈先快速增加后緩慢增加的趨勢。0～10 min，樣品中檸檬烯整體釋放量較高，釋放速率較快。10～20 min，樣品中檸檬烯釋放速率顯著降低。20～65 min，樣品中檸檬烯基本不再釋放。3）不同溫度下橘皮釋放行為更符合一級釋放模型，模型擬合相關(guān)系數(shù)R2值介于0.906～0.997 范圍。