劉國(guó)榮，聶 蓉，段嬌嬌，王成濤

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048）

大多數(shù)天然存在人體腸道中的益生菌，如糞腸球菌（Enterococcus faecalis），通常是來(lái)源于發(fā)酵食品。例如：酸奶、奶酪、發(fā)酵香腸、酸菜等。其中能代謝合成細(xì)菌素的菌株，因細(xì)菌素對(duì)致病菌的抑制作用[1]以及不具有抗藥性，而極大地增強(qiáng)了對(duì)人體健康的益生功效[2]。糞腸球菌Gr17 分離自中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚(yú)，可以代謝合成新型廣譜IIa 細(xì)菌素enterocin Gr17。enterocin Gr17 具有良好的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性，在pH 2～10 條件下仍具有抑菌能力，100 ℃加熱30 min 與121 ℃加熱15 min 后，其抑菌活性可分別保留95.26%和90.35%[3]。糞腸球菌Gr17 有作為發(fā)酵食品功能性菌株的巨大應(yīng)用潛力。

許多IIa 類(lèi)細(xì)菌素代謝合成受種群內(nèi)部 （種內(nèi)）三組分群體感應(yīng)系統(tǒng)[4-5]（Quorum sensing，QS）調(diào)控，該系統(tǒng)包括擔(dān)當(dāng)種內(nèi)信號(hào)分子的自誘導(dǎo)肽 （Autoinducing peptide，AIP） 和雙組分系統(tǒng)（Two component system，TCS），其中TCS 由組氨酸蛋白激酶（Histidine protein kinase，HPK）和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白 （Response regulator protein，RR）組成[4-5]，AIP 的分泌需要ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助。前期研究表明，添加AIP 粗提液可誘導(dǎo)糞腸球菌Gr17 合成細(xì)菌素，且在糞腸球菌Gr17 中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)基因[6]（as-48E、as-48F、as-48G、as-48H）、雙組分基因（entPK、entR）、自誘導(dǎo)肽基因（entIP）和細(xì)菌素編碼基因（entGr17），這表明種內(nèi)三組分群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控細(xì)菌素enterocin Gr17 的代謝合成過(guò)程[3]。

實(shí)際發(fā)酵環(huán)境中糞腸球菌Gr17 會(huì)面臨多種脅迫條件[7]，包括酸脅迫[8-10]、鹽脅迫[11]、溫度脅迫[12]、氧脅迫[13]、乙醇脅迫[14]和營(yíng)養(yǎng)脅迫[15]等。因發(fā)酵過(guò)程會(huì)積累大量的酸[16]，而大部分乳酸菌是嗜中性微生物[17]，不耐受酸性環(huán)境，導(dǎo)致生長(zhǎng)代謝緩慢甚至死亡，因此說(shuō)酸脅迫是重要的脅迫因素。不過(guò)，酸脅迫具有雙重效應(yīng)，一些微生物經(jīng)過(guò)弱酸脅迫處理會(huì)產(chǎn)生一定的適應(yīng)性[17]，對(duì)自身產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，甚至可促使某些代謝產(chǎn)物的過(guò)量合成[18]。董穎穎等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與強(qiáng)酸脅迫（pH 1.5）相比，弱酸脅迫（pH 3.5）條件處理產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）SZU 07-01 可促進(jìn)谷胱甘肽的過(guò)量合成。

目前，尚不清楚酸脅迫能否增強(qiáng)糞腸球菌Gr17 合成細(xì)菌素的能力，能否通過(guò)影響種內(nèi)三組分群體感應(yīng)系統(tǒng)以增加糞腸球菌Gr17 的合成量。為此，本研究探討不同酸脅迫條件對(duì)菌株Gr17 生長(zhǎng)及代謝合成細(xì)菌素的影響，篩選可正向影響細(xì)菌素合成的酸脅迫條件參數(shù)。通過(guò)確定群體檢測(cè)系統(tǒng)和與細(xì)菌素生物合成有關(guān)的基因表達(dá)水平，初步分析酸脅迫正向調(diào)控糞腸球菌Gr17 合成細(xì)菌素的機(jī)理。全面揭示實(shí)際發(fā)酵環(huán)境中分子水平上乳酸菌細(xì)菌素合成的調(diào)控行為，最大限度地提高乳酸菌生產(chǎn)菌素的應(yīng)用價(jià)值，具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 糞腸球菌 （Enterococcus faecalis）Gr17 于實(shí)驗(yàn)室分離保藏；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）1.90，由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 主要試劑 硫酸銨、NaOH、HCl、無(wú)水乙醇、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、SYB Green 染料，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆固體（TSA）培養(yǎng)基，上海恪敏生物科技有限公司；DNA Maker、瓊脂糖、RNA 制備Pure Cell/Bacterla 試劑盒RNA 提取試劑盒、DNaseI（無(wú)RNase）和RNase 抑制劑、細(xì)菌基因組DNA 提取試 劑 盒（DP302）、qPCR Master Mix、SuperReal PreMix Plus（SYBR 綠色），翌圣生物科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UB-7pH 計(jì)，美國(guó)DENVER 儀器公司；C1000 Touch PCR 儀，閎龍生物科技（上海）有限公司；Bio Spectrum 凝膠成像儀，美國(guó)UVP 公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；CFX96 Touch熒光定量PCR 儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；BG-Power 300型電泳儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；牛津杯（10 mm×7.8 mm×6 mm），廣州標(biāo)邁生物科技有限公司；TGL-20M 低溫離心機(jī)，邢臺(tái)潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司；SPX-150B 生化培養(yǎng)箱，杭州聚萊儀器有限公司；LDZX-75KB 立式壓力滅菌器，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；Supra 22K 大容量高速冷凍離心機(jī)，北京中儀遠(yuǎn)大科技有限公司；渦旋振蕩器，上海鼎科科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 的培養(yǎng)將儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱中的菌株（1 mL）接種到裝有50 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 錐形燒杯中，在振蕩器中以180 r/min 速度37 ℃培養(yǎng)24 h。

將種子液接種到裝有3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為10%，起始速度為350 r/min，通氣率為3.0 L/min。手動(dòng)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速 （300～900 r/min）將溶氧水平控制在30%以上，使用梅特勒電極監(jiān)測(cè)pH 值，并且添加3 mol/L HCl 溶液或3 mol/L NaOH 將溶液pH 值調(diào)至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，以pH 7.0 的正常狀態(tài)為對(duì)照，在37℃下培養(yǎng)28 h，得糞腸球菌Gr17 發(fā)酵液。

1.3.2 可正向調(diào)控細(xì)菌素合成的最佳酸脅迫條件篩選 測(cè)定不同酸脅迫條件對(duì)菌株Gr17 生長(zhǎng)的影響。分別取200 μL 不同酸脅迫條件下培養(yǎng)的糞腸球菌Gr17 發(fā)酵液至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm 處的吸光值。

測(cè)定不同酸脅迫條件下細(xì)菌素enterocin Gr17 的效價(jià)。將1.3.1 節(jié)中獲得的糞腸球菌Gr17發(fā)酵肉湯以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心20 min，提取上清液，用2.5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.0，并用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾。將80%硫酸銨溶液添加到上清液中，置4 ℃冰箱中過(guò)夜沉淀。以10 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集沉淀物。將沉淀物重新溶解在0.02 mol/L 磷酸鹽溶液（pH 7.0）中，即不同酸脅迫條件下細(xì)菌素enterocin Gr17 粗提液。

取不同酸脅迫和正常條件下的細(xì)菌素enterocin Gr17 粗提液，參照抗生素效價(jià)測(cè)定方法--管碟法[20]測(cè)定其對(duì)指示菌大腸桿菌1.90 的效價(jià)（AU/mL），代表enterocin Gr17 的分泌情況。與正常條件為對(duì)照，以增加enterocin Gr17 效價(jià)最顯著的酸脅迫條件為可正向調(diào)控細(xì)菌素合成的最佳酸脅迫條件。

其中表示通信拓?fù)渥訄D的鄰接矩陣Aσ的元素；M表示系統(tǒng)所有可能的通信拓?fù)淝闆r.通過(guò)構(gòu)造代價(jià)指標(biāo)T，可展開(kāi)對(duì)編隊(duì)系統(tǒng)模型優(yōu)劣性的分析，從而證明本文所提脈沖控制方法在節(jié)約時(shí)間和能量方面的優(yōu)越性.

1.3.3 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 菌體生長(zhǎng)代謝及細(xì)菌素分泌情況 通過(guò)比較最佳酸脅迫條件下和糞腸球菌Gr17 在不同發(fā)酵時(shí)間菌體生長(zhǎng)代謝及細(xì)菌素分泌情況，探究酸脅迫對(duì)菌株Gr17 合成細(xì)菌素在表觀水平上的影響程度。

1.3.3.1 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 菌體生長(zhǎng)代謝情況 分別取200 μL 不同發(fā)酵時(shí)期的糞腸球菌Gr17 發(fā)酵液至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在600 nm 處的吸光值。

1.3.3.2 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 細(xì)菌素分泌情況 參照1.3.2 節(jié)方法，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌素enterocin Gr17 的效價(jià)，代表enterocin Gr17 的分泌情況。

1.3.4 最佳酸脅迫下細(xì)菌素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化 在1.3.2 節(jié)確定的最佳酸脅迫條件下，采用RT-qPCR 技術(shù)研究不同發(fā)酵時(shí)期菌株Gr17 所分泌細(xì)菌素編碼的結(jié)構(gòu)基因（entGr17）；細(xì)菌素調(diào)控相關(guān)的雙組分系統(tǒng)的基因（entPK、entR），調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的信號(hào)分子自誘導(dǎo)肽基因（entIP）；轉(zhuǎn)運(yùn)自誘導(dǎo)肽AIP 的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因[6]（as-48E、as-48F、as-48G、as-48H） 的差異表達(dá)情況及變化規(guī)律，從分子水平全面揭示細(xì)菌素enterocin Gr17 在實(shí)際發(fā)酵環(huán)境中的合成調(diào)控行為。

1.3.4.1 糞腸球菌Gr17 總RNA 提取 每4 h 取酸脅迫和正常條件（pH 7.0）下的發(fā)酵液，10 000 r/min 離心獲得細(xì)菌細(xì)胞。使用RNAprep 純多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，按照說(shuō)明操作從糞腸球菌Gr17 中提取總RNA，并將其儲(chǔ)存在-80 ℃下。

1.3.4.2 反轉(zhuǎn)錄RNA 使用Tiangen FastQuant cDNA 的第一個(gè)鏈合成組，具體操作方法：1）融化RNA 模板，5×gDNA 緩沖液、FQ-RT 引物混合物、10×快速RT 緩沖液、冰上無(wú)RNase 的ddH2O，渦旋并在使用前短暫混合每種溶液。2）將2 μL 5×gDNA 緩沖液、50 ng 總RNA 和無(wú)RNase 的ddH2O制成10 μL 混合溶液并充分混勻，然后42 ℃孵育3 min，置于冰上。3）將2 μL 10×快速RT 緩沖液、1 μ LRT 酶混合物，2 μL FQ-RT 引物混合物和5 μL 不含RNase 的ddH2O 充分混合。4）混合步驟2和步驟3 中獲得的液體混合物，42 ℃孵育15 min后在95 ℃孵育3 min，然后置于冰上以獲得cDNA。

1.3.4.3 RT-qPCR 分析 以糞腸球菌Gr17 基因entGr17、entIP、entPK、entR、as-48H、as-48G、as-48F、as-48E 為檢測(cè)目標(biāo)，16s RNA 作為內(nèi)參基因，通過(guò)Primers Blast 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR 使用天根生化科技（北京）有限公司的增強(qiáng)定量熒光SuperReal 陣列（SYBR Green）預(yù)混合試劑（SYBR Green）。設(shè)計(jì)并放大了反應(yīng)體系，具體操作方法如下：

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers uesd for RT-qPCR

表2 RT-qPCR 反應(yīng)體系Table 2 RT-qPCR reaction system

實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)條件：采用兩步法PCR 反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)，即：95.0 ℃變性2 min，94.0 ℃擴(kuò)增20 s，63.0 ℃退火45 s，40 個(gè)循環(huán)，60.0 ℃延伸5 min。以16s RNA 為內(nèi)參基因，以對(duì)應(yīng)空白試驗(yàn)組作為對(duì)照，采用2－ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 可正向調(diào)控細(xì)菌素合成的最佳酸脅迫條件

糞腸球菌Gr17 在弱酸性條件下生長(zhǎng)良好，在強(qiáng)酸性條件下生長(zhǎng)受到抑制，enterocin Gr17 的抑菌活性與菌體密度的變化趨勢(shì)一致。如圖1所示，弱酸性條件 （pH 5.0，5.5，6.0，6.5） 下糞腸球菌Gr17 的菌體密度顯著高于正常條件（pH 7.0）；強(qiáng)酸性條件（pH 4.0，4.5）下糞腸球菌Gr17 的菌體密度顯著低于正常條件。enterocin Gr17 的抑菌活性與菌體密度的變化成正比，當(dāng)pH 值為5.5 時(shí)，糞腸球菌Gr17 的菌體密度和enterocin Gr17 的抑菌活性達(dá)到最高，抑菌活性是正常條件下的150%；當(dāng)pH 值在4.0～5.5 之間時(shí)，糞腸球菌Gr17的菌體密度和enterocin Gr17 的抑菌活性隨pH的增加而上升；當(dāng)pH 值在5.5～7.0 之間時(shí)，enterocin Gr17 的抑菌活性隨pH 值的增加而下降。上述結(jié)果表明，弱酸脅迫可使糞腸球菌Gr17 過(guò)量代謝合成enterocin Gr17，在pH 5.5 的酸脅迫條件下提高enterocin Gr17 抑菌活性的效果最顯著。

圖1 不同pH 條件下糞腸球菌Gr17 的菌體密度與抑菌活性Fig.1 Cell density and antibacterial activity of Enterococcus faecalis Gr17 under different pH conditions

2.2 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 菌體生長(zhǎng)代謝情況

比較pH 5.5 的弱酸脅迫條件與正常條件下，糞腸球菌Gr17 的菌體密度與抑菌活性隨時(shí)間的變化情況。如圖2所示，0～4 h 時(shí)，pH 5.5 的酸脅迫下糞腸球菌Gr17 的菌體密度低于正常條件；4～8 h 時(shí)，pH 5.5 的酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 的菌體密度略高于正常條件；12～40 h 時(shí)，pH 5.5 的酸脅迫下糞腸球菌Gr17 的菌體密度遠(yuǎn)低于正常條件。上述結(jié)果表明，弱酸脅迫有利于糞腸球菌Gr17 在延滯期適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，從而快速繁殖。在穩(wěn)定期弱酸脅迫顯著抑制其生長(zhǎng)，這可能是后期糞腸球菌所產(chǎn)有機(jī)酸抑制自身生長(zhǎng)的緣故。

圖2 pH 5.5 與pH 7.0 下糞腸球菌Gr17 的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Enterococcus faecalis Gr17 at pH 5.5 and pH 7.0

2.3 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 細(xì)菌素分泌情況

比較pH 5.5 的酸脅迫與正常條件下，糞腸球菌Gr17 的抑菌活性隨時(shí)間的變化情況。如圖3所示，糞腸球菌Gr17 在兩種條件下均從8 h 開(kāi)始合成enterocin Gr17，分別在28 h 和32 h 開(kāi)始降解enterocin Gr17。兩種條件下到達(dá)抑菌活性最大峰值的時(shí)間有所不同，正常條件下，enterocin Gr17的合成量在24 h 達(dá)到峰值。pH 5.5 的酸脅迫條件下，enterocin Gr17 的合成量在28 h 達(dá)到峰值。雖然pH 5.5 的酸脅迫條件下enterocin Gr17 到達(dá)最大合成量的時(shí)間有所延遲，但是各時(shí)間點(diǎn)enterocin Gr17 合成量均比在正常條件下有明顯提高。

圖3 pH 5.5 與pH 7.0 下糞腸球菌Gr17 的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of Enterococcus faecalis Gr17 at pH 5.5 and pH 7.0

2.4 最佳酸脅迫下細(xì)菌素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

2.4.1 細(xì)菌素編碼基因轉(zhuǎn)錄水平 如圖4所示，細(xì)菌素編碼基因（entGr17）的相對(duì)表達(dá)的變化方向?qū)?yīng)于生長(zhǎng)曲線和抗菌活性的變化方向。4～8 h時(shí)，pH 5.5 的酸脅迫條件與正常條件下entGr17基因的相對(duì)表達(dá)量相近；12～36 h 時(shí)，pH 5.5 的酸脅迫條件下entGr17 基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常條件；36～40 h 時(shí)，entGr17 基因的相對(duì)表達(dá)量驟然下降，這與36～40 h 時(shí)enterocin Gr17 分泌量的下降趨勢(shì)一致。

圖4 entGr17 相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of entGr17

2.4.2 細(xì)菌素調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 自誘導(dǎo)肽基因（entIP）和雙組分基因（entPK、entR）的相對(duì)表達(dá)方向?qū)?yīng)于生長(zhǎng)曲線和抗菌活性的方向。如圖5所示，在pH 5.5 的酸脅迫條件下，糞腸球菌Gr17 的entIP 基因的相對(duì)表達(dá)從8 h 開(kāi)始急劇增加，在20 h 達(dá)到峰值，在36 h 開(kāi)始有所下降。20～36 h 時(shí)，entIP 基因的相對(duì)表達(dá)量與峰值幾乎持平。這表明糞腸球菌在8 h 時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生AIP，在20 h 時(shí)AIP 的濃度達(dá)到最大，并在20～36 h 持續(xù)處于高水平，從36 h 開(kāi)始AIP 濃度下降，仍然高于8 h時(shí)的濃度。正常條件下，entIP 基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與pH 5.5 的類(lèi)似，在24 h 達(dá)到峰值。比較酸脅迫與正常條件下entIP 基因的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)8～40 h 內(nèi)pH 5.5 的酸脅迫條件下entIP 基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常條件。

圖5 entIP 相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of entIP

雙組分基因（entPK、entR）相對(duì)表達(dá)量的變化與entIP 基因一致，不同點(diǎn)在于12 h 時(shí)pH 5.5 的酸脅迫條件下entPK、entR 基因的相對(duì)表達(dá)量才開(kāi)始高于正常條件，比entIP 基因滯后4 h，且entPK、entR 基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量都低于entIP 基因。

2.4.3 細(xì)菌素ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄水平 如圖8所示，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因 （as-48E、as-48F、as-48G、as-48H）的相對(duì)表達(dá)量整體而言呈先增長(zhǎng)后減少的變化趨勢(shì)，變化程度遠(yuǎn)小于entGr17、entIP、entPK、entR 基因，結(jié)果不顯著。對(duì)于as-48E、as-48F、as-48G 基因，12～40 h 內(nèi)pH 5.5 的酸脅迫條件下其相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常條件；對(duì)于as-48H 基因，16～24 h 內(nèi)pH 5.5 的酸脅迫條件下其相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常條件。

圖6 entPK 相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of entPK

圖7 entR 相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of entR

圖8 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of ABC transport system related genes

3 討論與結(jié)論

本研究表明，pH 5.5 的酸脅迫條件使糞腸球菌Gr17 過(guò)量代謝合成enterocin Gr17。不論是在酸脅迫條件下，還是在正常條件下，enterocin Gr17的合成量都呈現(xiàn)出菌體密度依賴(lài)性，這是enterocin Gr17 合成受種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的表觀體現(xiàn)。pH 5.5 的酸脅迫條件下，糞腸球菌Gr17 的菌體密度小于正常條件，這不利于其產(chǎn)生細(xì)菌素，然而細(xì)菌素enterocin Gr17 的產(chǎn)量卻在此條件下更高。為此，對(duì)pH 5.5 的酸脅迫條件與正常條件下與enterocin Gr17 代謝合成的相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平比較，發(fā)現(xiàn)pH 5.5 的酸脅迫條件較正常條件，細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因（entGr17）的相對(duì)表達(dá)量在12～40 h 顯著增加，與抑菌活性的變化趨勢(shì)一致；自誘導(dǎo)肽基因（entIP）的相對(duì)表達(dá)量在8～40 h 顯著增加；雙組分基因（entPK、entR）的相對(duì)表達(dá)量在12～40 h 顯著增加；ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因（as-48E、as-48F、as-48G）的相對(duì)表達(dá)量在12～40 h 增加，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因（as-48H）在16～40 h 增加。上述結(jié)果表明，酸脅迫通過(guò)影響種內(nèi)三組分群體感應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)而影響糞腸球菌Gr17 代謝合成enterocin Gr17。

種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)在乳酸菌代謝產(chǎn)細(xì)菌素中發(fā)揮調(diào)控作用的過(guò)程[4]可分為以下幾步：1）乳酸菌合成前體信號(hào)分子，然后修飾其成為成熟的自誘導(dǎo)肽AIP[21]，AIP 無(wú)法自行分泌到胞外，需借助ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或其它膜通道蛋白[22]；2）當(dāng)細(xì)菌大量繁殖，種群密度不斷增加使胞外的信號(hào)分子AIP 大量積累，達(dá)到閾值；3）AIP 激活位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的雙組分系統(tǒng)[23]，通過(guò)磷酸化的方式將種內(nèi)群體感應(yīng)信號(hào)傳遞給下游靶基因，并調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)。相應(yīng)的，RT-qPCR 試驗(yàn)結(jié)果表明，弱酸脅迫與正常條件中的糞腸球菌Gr17 相比，自誘導(dǎo)肽基因（entGr17）轉(zhuǎn)錄水平率先增高，弱酸脅迫使糞腸球菌Gr17 更早地合成AIP；ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因 （as-48E、as-48F、as-48G、as-48H）和雙組分基因 （entPK、entR） 的相對(duì)表達(dá)量隨后增高，然而ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的增加量小于雙組分基因的增加量，一方面可能是由于糞腸球菌Gr17 依賴(lài)其它膜通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)AIP，另一方面由于這些蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的氨基酸通常含有可電離基團(tuán)，外部pH 值可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性和親和力[24]。同時(shí)，收到傳遞信號(hào)的細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因（entGr17）的轉(zhuǎn)錄水平也明顯增強(qiáng)。

乳酸菌雙組分系統(tǒng)和LuxS/AI-2 介導(dǎo)的種群之間（種間）群體感應(yīng)系統(tǒng)，即種間信息交流機(jī)制，對(duì)乳酸菌的耐酸性有影響。Azcarate-Peril 等[25]構(gòu)建缺失HPK 突變株，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌NCFM 的耐酸性明顯下降，并且該過(guò)程中LuxS 基因的表達(dá)水平上調(diào)。Moslehi-Jenabian 等[26]在pH 3.0，4.0，5.0，6.5（作為對(duì)照）條件下，分別對(duì)鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，NCFM）進(jìn)行酸性休克試驗(yàn)，測(cè)定了AI-2 活性和LuxS 基因的轉(zhuǎn)錄水平。AI-2活性隨pH 值的降低而增加，而菌株適應(yīng)酸性環(huán)境后AI-2 的活性下降。LuxS 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化與AI-2 一致，酸適應(yīng)能減弱LuxS 基因的轉(zhuǎn)錄?；蛟S，酸脅迫也影響糞腸球菌Gr17 由LuxS/AI-2介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)，甚至該系統(tǒng)與細(xì)菌素的增產(chǎn)有密切關(guān)系。

本課題組接下來(lái)會(huì)構(gòu)建種內(nèi)信號(hào)分子entIP基因缺失突變株，并針對(duì)弱酸脅迫下LuxS/AI-2介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌素enterocin Gr17 代謝合成的影響展開(kāi)研究，探究種內(nèi)或種間群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)菌素enterocin Gr17 合成中的調(diào)控效應(yīng)。