任仲麗， 張秀花， 王 靜， 劉 博， 李秀菊

(菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院生物檢測(cè)研究所，山東 菏澤 274023)

柴胡注射液是柴胡干燥根經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液，主要成分為揮發(fā)油(柴胡醇、丁香酚等)，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣的作用[1-3]。高陽(yáng)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡注射液對(duì)脂多糖導(dǎo)致的高熱有較強(qiáng)的解熱作用，解熱療效確切，臨床應(yīng)用廣泛。但由于不良反應(yīng)較多，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)生產(chǎn)柴胡注射液的企業(yè)從2012年的120家左右減到現(xiàn)在的70家[5-7]。同時(shí)，由于兒童群體的不良反應(yīng)占比較大[8-13]，2018年5月29日國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布公告，修訂柴胡注射液說(shuō)明書，增加“兒童禁用”條款[14]。本研究依照2020年版《中國(guó)藥典》四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的凝膠法，建立和探討柴胡注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的可行性，以期為制藥企業(yè)提高藥品質(zhì)量、減少由于熱原引起的不良反應(yīng)、確保用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 柴胡注射液1(河南福森藥業(yè)有限公司，批號(hào)1805061，2 mL/支)；柴胡注射液2(河南省康華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)18082603A，2 mL/支)；柴胡注射液3(海南制藥廠有限公司制藥二廠，批號(hào)180101052，2 mL/支)；柴胡注射液4(河南福森藥業(yè)有限公司，批號(hào)1802011，2 mL/支)；柴胡注射液5(河南省康華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)19051202，2 mL/支)；柴胡注射液6(海南制藥廠有限公司制藥二廠，批號(hào)180101263，2 mL/支)。

1.2 試劑 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WSE，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)150601-202088，60 EU/支)。鱟試劑1(TAL1，湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25 EU/mL，0.1 mL/支，批號(hào)1907081)；鱟試劑2(TAL2，湛江博康海洋生物有限公司，靈敏度0.25 EU/mL，0.1 mL/支，批號(hào)1904032)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET，廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，10 mL/支，批號(hào)20036004)。

1.3 儀器 TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司)；ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素限值的確定 按照2020年版《中國(guó)藥典》四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，藥品細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)=K/M，K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量。注射劑K為5 EU/(kg·h)，根據(jù)柴胡注射液說(shuō)明書，一次最大注射量為4 mL，計(jì)算得到M為0.067 mL/(kg·h)，即細(xì)菌內(nèi)毒素限值為75 EU/mL[15]。

參照2020年版《中國(guó)藥典》四部9301細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)下對(duì)限值設(shè)定的建議，同時(shí)考慮到柴胡注射液臨床上常聯(lián)合用藥且不良反應(yīng)較多，嚴(yán)格控制細(xì)菌內(nèi)毒素限值為其計(jì)算限值的1/5，即以15 EU/mL為最終內(nèi)毒素限值[15]。

2.2 確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》四部9301規(guī)定，結(jié)合常用鱟試劑的靈敏度，公式為MVD=cL/λ，c為供試品溶液濃度，λ為鱟試劑靈敏度，依次得MVD為60、120、240、480倍[15]。

2.3 TAL靈敏度復(fù)核 本實(shí)驗(yàn)選用標(biāo)示靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則1143規(guī)定，首先進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核[15]，按公式λc=anti1g(∑X/n)計(jì)算鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)。λc均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，表明TAL1、TAL2可用標(biāo)示靈敏度0.25 EU/mL為該批次鱟試劑的靈敏度，并可用于干擾試驗(yàn)及供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，見表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果(n=4)

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算MVD，將2家企業(yè)生產(chǎn)的2批柴胡注射液用BET水稀釋30、60、120、240、480倍，作為供試品溶液(NPC)，其中2λ濃度的溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(PPC)，按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則1143規(guī)定測(cè)定，結(jié)果見表2。由此可初步判定，柴胡注射液稀釋30倍時(shí)，對(duì)2個(gè)廠家TAL與WSE無(wú)明顯干擾抑制作用。

表2 柴胡注射液干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果(n=2)

為進(jìn)一步確定柴胡注射液對(duì)TAL與WSE的干擾作用，取上述2家企業(yè)生產(chǎn)的2批柴胡注射液原液及用BET水稀釋2、4、8、15倍的供試品溶液重復(fù)進(jìn)行上述試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由此可初步判定，柴胡注射液原液對(duì)2個(gè)廠家的TAL與WSE無(wú)明顯干擾抑制作用，可進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。

表3 柴胡注射液干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果(n=2)

2.5 正式干擾試驗(yàn) 為了最終確認(rèn)柴胡注射液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是否存在干擾抑制作用，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下結(jié)果，取3家企業(yè)生產(chǎn)的3批柴胡注射液，使用2個(gè)廠家生產(chǎn)的標(biāo)示靈敏度為0.25 EU/mL的TAL，按照2020年版《中國(guó)藥典》四部1143中凝膠法干擾試驗(yàn)要求操作，結(jié)果見表4。由此可知，按照2020年版《中國(guó)藥典》的判斷標(biāo)準(zhǔn)，柴胡注射液原液對(duì)2個(gè)廠家的TAL與WSE無(wú)明顯干擾抑制作用，確定柴胡注射液可使用現(xiàn)市售標(biāo)示靈敏度為0.25～0.03 EU/mL TAL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

表4 柴胡注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 另取3家企業(yè)生產(chǎn)的3批柴胡注射液，按本研究建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行常規(guī)檢查，驗(yàn)證方法的可行性，結(jié)果見表5。由此可知，按本研究方法檢查時(shí)均符合規(guī)定。

表5 柴胡注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果(n=2)

2.7 凝膠半定量試驗(yàn) 為驗(yàn)證凝膠限度試驗(yàn)與凝膠半定量試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果的一致性，取3家企業(yè)生產(chǎn)的3批柴胡注射液，制成原液及2、4、8倍稀釋溶液，作為供試品溶液；用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照；用柴胡注射液原液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液，作為供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液，同時(shí)用BET水作為陰性對(duì)照，使用2個(gè)廠家生產(chǎn)的標(biāo)示靈敏度為0.25EU/mL的TAL，按照2020年版《中國(guó)藥典》四部1143中凝膠半定量試驗(yàn)要求操作，結(jié)果見表6。由此可知，3家企業(yè)生產(chǎn)的3批柴胡注射液的系列稀釋供試品溶液均為陰性，則細(xì)菌內(nèi)毒素含量低于0.25 EU/mL。

表6 柴胡注射液凝膠半定量試驗(yàn)結(jié)果(n=2)

2.8 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)草案 取本品依法(2020年版《中國(guó)藥典》四部通則1143)檢查，規(guī)定柴胡注射液中含內(nèi)毒素含量應(yīng)低于15 EU/mL。

3 討論

柴胡注射液是我國(guó)自主研發(fā)成功的第一個(gè)中藥注射劑，對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展具有重要的意義[16-17]，廣泛應(yīng)用于臨床，但由于生產(chǎn)工藝、原輔料等條件的制約，其不良反應(yīng)也被頻繁報(bào)道。因此，監(jiān)管部門明文規(guī)定柴胡注射液“兒童禁用”[8-14]。

眾所周知，注射劑常見的不良反應(yīng)之一就是引起熱源反應(yīng)，柴胡注射液在臨床上通常與西藥聯(lián)合用藥，更容易導(dǎo)致內(nèi)毒素超標(biāo)，而且柴胡注射液為純中藥制劑，成分復(fù)雜，從臨床用藥安全等多方面考慮，有必要增加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[18-23]。目前，我國(guó)現(xiàn)行柴胡注射液檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中沒有細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)目，而是采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法的熱原檢查項(xiàng)目，但其操作繁瑣，結(jié)果受家兔個(gè)體差異的影響較大，并會(huì)對(duì)動(dòng)物造成一定的傷害。

本研究為避免上述問(wèn)題，探索替代熱原檢查法的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，通過(guò)干擾預(yù)試驗(yàn)、正式干擾試驗(yàn)確定柴胡注射液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是否存在干擾作用，確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)設(shè)定細(xì)菌內(nèi)毒素限值為15 EU/mL時(shí)，使用標(biāo)示靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，采用凝膠法進(jìn)行柴胡注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的，并通過(guò)凝膠半定量法驗(yàn)證了凝膠限度試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果的一致性，為建立柴胡注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，建議將柴胡注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的熱原檢查項(xiàng)改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，規(guī)定其含量應(yīng)低于15 EU/mL。