王 玉， 靳曉杰#， 趙 磊， 夏鵬飛， 羅 宏， 李潮新， 石生青， 劉秀珠，張志明， 劉永琦,6*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；6.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

自新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)爆發(fā)以來[1]，已波及全球204個國家和地區(qū)，COVID-19具有潛伏期長、傳染性強、各類人群普遍易感且臨床表現(xiàn)多樣等特點，嚴重者可快速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、出凝血功能障礙、腎衰竭，甚至死亡[2]。SARS-CoV-2是一種新發(fā)現(xiàn)的β屬冠狀病毒，目前對這種病毒的認識較初淺，且COVID-19的臨床治療主要是對癥治療，尚無特效藥物，因此迫切需要尋找并開發(fā)新的治療方法和藥物[3]。COVID-19屬于中醫(yī)疫病范疇，病因為感受疫戾之氣，病位在肺，病機特點為“濕、熱、毒、瘀”，中醫(yī)辨證論治方案多以開肺化痰、解毒活血類中成藥為主，其中連花清瘟顆粒為治療乏力伴發(fā)熱者的代表性藥物。

連花清瘟顆粒由連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草13味藥材組成，針對COVID-19“疫毒外侵，熱毒襲肺”的病機特點，連花清瘟顆粒能夠發(fā)揮其宣肅肺氣、清化痰熱、解毒活血的功效，緩解COVID-19患者初期的發(fā)熱、呼吸道癥狀，同時達到衛(wèi)氣同治、表里雙解、整體調(diào)節(jié)的治療效果，有助于阻斷患者較快進入“炎癥風暴”。

分子對接技術(shù)是指利用計算機輔助模擬將配體與受體蛋白結(jié)合，通過化學(xué)計量學(xué)方法模擬兩者的低能結(jié)合過程[4]；系統(tǒng)生物學(xué)是通過數(shù)據(jù)庫檢索、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析和計算機模擬等多種技術(shù)構(gòu)建多層次、多結(jié)構(gòu)、多維度網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)從系統(tǒng)水平研究藥物多靶標、多成分、多途徑的作用規(guī)律[5]，在中藥復(fù)方活性成分和機制研究中得到了充分的應(yīng)用[6]。研究證實SARS-CoV-2通過血管緊張素換酶2(ACE2)感染人體細胞[7-8]，提示靶向阻斷SARS-CoV-2 S蛋白可作為抗COVID-19藥物設(shè)計的關(guān)鍵靶標。本研究采用分子對接、聚類分析及靶向篩選的系統(tǒng)研究方法，對連花清瘟顆粒系統(tǒng)調(diào)節(jié)、SARS-CoV-2 S靶向阻斷治療COVID-19的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制進行了不同層次的探索，以期為抗COVID-19藥物研發(fā)和指導(dǎo)臨床用藥提供理論參考。

1 方法

1.1 化合物信息收集 借助TCMSP(http://tcmspw.com/index.php)、TCMID(http://119.3.41.228：8000/tcmid/)數(shù)據(jù)庫等平臺，以連花清瘟顆粒所含13味中藥為關(guān)鍵詞，整理分析其化合物。檢索ETCM(http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/)數(shù)據(jù)庫和查詢文獻收集所含中藥的歸經(jīng)，并構(gòu)建“藥材-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)模型。

1.2 成分-SARS-CoV-2 S分子對接 本研究選擇S晶體結(jié)構(gòu)作為分子對接的晶體結(jié)構(gòu)，將連花清瘟顆粒所含化合物與SARS-CoV-2 S空間形狀的匹配情況采用Schroding 9.4.5軟件的Glide模塊進行分子對接，根據(jù)系統(tǒng)能量的大小進行打分并通過Lipinski規(guī)則(分子量小于500，氫鍵給體數(shù)目小于5，氫鍵受體數(shù)目小于10，脂水分配系數(shù)小于5，可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10)篩選其關(guān)鍵性成分，并分析關(guān)鍵成分和SARS-CoV-2 S靶蛋白的結(jié)合模式。

1.3 活性成分篩選、靶點預(yù)測及層次聚類分析 對連花清瘟顆粒中連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、藿香、大黃、薄荷腦所含化合物中符合口服生物利用度(OB)≥30%(甘草OB≥40%)、類藥性(DL)≥0.18者作為活性成分，而紅景天借助TCMID數(shù)據(jù)庫及類藥五原則篩選得到者作為活性成分。通過基于分子相似性原理預(yù)測小分子化合物的作用靶點數(shù)據(jù)庫SwissTarget(http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索概率值(Probablity)≥0.5的大分子作為活性成分的潛在相關(guān)靶標蛋白。將符合篩選條件的活性成分及其對應(yīng)的作用靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥材-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)模型，通過模型中度值(degree)大于其平均值的指標作進一步篩選，并采用化學(xué)信息學(xué)軟件包canvas計算化學(xué)小分子化合物分子指紋，然后通過基于相似性矩陣的層次聚類方法對重要化合物結(jié)構(gòu)屬性進行聚類，類間距離選擇簇間平均距離法。

1.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING平臺(https://string-db.org/)，導(dǎo)入篩選后主要靶蛋白，將蛋白質(zhì)種類設(shè)置為“Homosapiens”，作用閾值設(shè)置為“medium confidence≥0.7”，其他條件保持默認設(shè)置進行操作，并構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。采用Cytoscapec 3.7.2插件中的MCODE模塊進一步對PPI進行模塊的劃分與分析，網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)節(jié)點連接度的臨界值大于3。

1.5 靶點通路分析 將篩選得到活性成分作用靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，分析潛在靶標蛋白基因的功能及其在信號通路中的作用，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人源(Homosapiens)，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱(official gene symbol)。經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，設(shè)定閾值P<0.05，進行GO生物學(xué)過程富集分析、KEGG信號通路富集分析，選取前20個條目，采用Prism軟件和在線繪圖站Omishare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)將其進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 化合物與SARS-CoV-2 S蛋白分子對接 連花清瘟顆粒中連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草所含化合物共1 769個，其中大黃92個，板藍根169個，連翹50個，金銀花236個，麻黃363個，苦杏仁113個，貫眾31個，魚腥草50個，廣藿香94個，薄荷164個，甘草280個，紅景天27個，將它們與SARS-CoV-2 S的分子進行對接，根據(jù)空間形狀匹配程度進行打分，篩選對接打分絕對值大于5 kcal/mol的小分子化合物共69個，通過Lipinski規(guī)則對以上結(jié)果進行篩選后得到7個，分別為芹菜素、桔皮素、刺槐素、去甲麻黃堿、大黃素甲醚、血清素、甘草查耳酮，其中芹菜素為薄荷、藿香、麻黃、金銀花共有成分，桔皮素、甘草查耳酮為甘草所含成分，大黃素甲醚、血清素為大黃所含成分，刺槐素、去甲麻黃堿分別為薄荷、麻黃所含成分，見表1。

表1 連花清瘟顆粒中7個核心化合物

2.2 藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)中連接度最大的2個節(jié)點是肺(lung)、胃(stomach)，度值(degree)分別是10、7，表明連花清瘟顆粒中大多數(shù)藥材歸于上述2經(jīng)，見圖1。

注：圓形代表歸經(jīng)，三角形代表中藥。圖1 連花清瘟顆粒藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 活性成分篩選、靶點預(yù)測及蛋白互作分析 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標準篩選出的活性成分共244種，其中大黃16種，板藍根39種，連翹、金銀花、麻黃各23種，苦杏仁19種，貫眾、魚腥草各7種，藿香11種，薄荷10種，甘草以O(shè)B≥40%、DL≥0.18為標準篩選出69種活性成分，紅景天經(jīng)類藥五原則篩選到20種活性成分；作用靶點1 362個，其中概率值(probability)≥0.5者149個，互作值(interaction score)≥0.7者145個。STRING數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白進行互作分析，結(jié)果見圖2，網(wǎng)絡(luò)共145個節(jié)點，346條邊，平均連接度是4.77，各節(jié)點表示作用靶點，每條邊表示各作用靶點之間的相互關(guān)系，顏色越深、節(jié)點越大表示該節(jié)點對應(yīng)的作用靶點越重要。對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，得到該網(wǎng)絡(luò)樞紐蛋白(圖3)，其中PIK3R1、APP、AKT1、EGFR、SRC、AR等靶點的度值顯著高于其他靶點，提示可能是連花清瘟顆粒治療COVID-19的關(guān)鍵作用靶點。

圖2 連花清瘟顆粒活性成分作用靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中識別的主要功能模塊

2.4 藥材-化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 藥材-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)共有341個節(jié)點，包括12種藥材節(jié)點、184個化合物節(jié)點、145個作用靶點節(jié)點，見圖4，充分體現(xiàn)了連花清瘟顆粒多成分與多靶點共同作用的整體性、關(guān)聯(lián)性特點。通過分析化合物-靶點的度值(degree)發(fā)現(xiàn)，大于平均值的關(guān)鍵性成分有51種，并進行結(jié)構(gòu)層次聚類分析，結(jié)果見圖5，可知主要包括黃酮、黃酮苷、甾醇、蒽醌等8類，其中黃酮類30種，占比58.8%，排名前5位的為MOL000098-槲皮素、MOL00422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL002823-草棉黃素、MOL000354-異鼠李素，分別與105、101、99、98、98個靶點蛋白發(fā)生作用，可能為連花清瘟顆粒核心成分。

圖4 連花清瘟顆粒藥材-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 連花清瘟顆粒中關(guān)鍵成分的聚類分析

前期報道，槲皮素、山柰酚、木犀草素與COVID-19緊密相關(guān)的靶點3CLpro和ACE2有較好的空間結(jié)合能力[9-10]；國外有研究認為，黃酮類化合物(如槲皮素、異鼠李素等)對干擾素TH-1和TH-2的調(diào)節(jié)作用有利于加強正常細胞的抗病毒能力[11]。從靶點的角度分析，排名前5位的關(guān)鍵靶點分別是HARS、AKT1、PIK3R1、ESR2、ADORA2A等，其中HARS、PIK3R1、AKT1等靶點均參與了非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路及小細胞肺癌過程；ADORA2A具有負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)功能，不僅能抑制T細胞功能，還可促進調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)育從而保護宿主免受過度的組織破壞。因此，連花清瘟顆粒阻斷SARS-CoV-2感染人肺部、延緩全身重要組織器官功能受損的可能作用機制為槲皮素、山柰酚、木犀草素、草棉黃素、異鼠李素等活性成分作用于HARS、AKT1、PIK3R1、ESR2及ADORA2A等靶點所致。

2.5 關(guān)鍵靶點通路分析 GO功能富集、KEGG通路富集分析結(jié)果見圖6，共得到GO條目554個(P<0.01)，其中生物過程(biological process，BP)條目449個，細胞組成(cell composition，CC)條目38個，分子功能(molecular function，MF)條目67個，分別占81%、2%、12%。KEGG通路富集分析篩選得到33條(P<0.05)信號通路，其中與肺炎相關(guān)的通路包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、B細胞受體通路(B cell receptor signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)；與肺損傷保護相關(guān)的通路包括MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、mTOR信號通路(mTOR signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路(neurotrophin signaling pathway)、Fc-epsilon-RI信號通路(Fc epsilon RI signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、胰島素信號通路(insulin signaling pathway)、類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)等；與癌癥相關(guān)的通路是癌癥通路(pathways in cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、結(jié)腸癌(colorectal cancer)等，其中非小細胞肺癌、小細胞肺癌、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、MAPK信號通路主要與肺炎相關(guān)[12]。

圖6 GO功能(A)、KEGG富集(B)分析圖

2.6 分子對接研究 以對接分數(shù)絕對值大于5 kcal/mol為條件，發(fā)現(xiàn)符合Lipinski規(guī)則的關(guān)鍵成分主要為芹菜素(藿香、麻黃、金銀花)、桔皮素(甘草)、刺槐素(薄荷)、去甲麻黃堿(麻黃)、甘草查耳酮(甘草)、大黃素甲醚(大黃)、血清素(大黃)7種成分，包括4種黃酮類、1種生物堿、1種蒽醌，見圖7，可知連花清瘟顆粒防治COVID-19主要以黃酮類或水解為黃酮類成分而發(fā)揮作用。與SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)合分值較高的化合物具有相同的母核結(jié)構(gòu)，其空間結(jié)合模式具有一定的相似性，其中A環(huán)上的羥基與氨基酸殘基Glu 484、Gly 485、Phe 490形成氫鍵，Tyr 489與A環(huán)形成π-π堆積作用，周圍的疏水性殘基進一步穩(wěn)定了化合物與蛋白的結(jié)合；芹菜素C環(huán)上的羰基亦與殘基Phe 490形成氫鍵，刺槐素的B環(huán)與殘基Phe 456形成π-π堆積作用，這些相互作用力確定了三維空間中化合物在結(jié)合區(qū)域中的位置，使得結(jié)合會更加穩(wěn)定。因此，基于相互作用模式推測，連花清瘟顆粒中阻斷SARS-CoV-2 S蛋白的化合物主要為具有黃酮骨架結(jié)構(gòu)的化合物，與靶點關(guān)鍵殘基形成氫鍵、π-π堆積和疏水作用。

圖7 分子對接模式圖

3 討論

連花清瘟顆粒(膠囊)是2003年“非典”時期由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院針對抗新型冠狀病毒SARS開發(fā)的，抑制SARS-CoV病毒的半數(shù)有效濃度(IC50)為0.09 mg/mL，其治療指數(shù)為40.33，可明顯抑制SARS病毒的復(fù)制，也是為數(shù)不多有證據(jù)表明具有抗SARS-CoV作用的中藥之一[13]。Walls等[14]研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 S蛋白的結(jié)構(gòu)域B與人ACE2具有較高的結(jié)合親和力，揭示了SARS-CoV-2在人類中的傳染性，提示SARS-CoV-2 S蛋白可能為抗COVID-19的有效靶點。因此，通過將連花清瘟中所含成分與其進行分子對接、靶點預(yù)測及層次聚類分析發(fā)現(xiàn)，連花清瘟顆粒中13味藥材的51種關(guān)鍵成分中黃酮類成分所占比最高(58.8%)，并且化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中以中心度值、親中心度值及度值篩選得到排名前10位的化合物如槲皮素、山柰酚、木犀草素、草棉黃素、異鼠李素、草質(zhì)素、金圣草(黃)素等，也均為黃酮類成分，提示連花清瘟顆?？赡芡ㄟ^黃酮或黃酮苷的形式作用于SARS-CoV-2 S靶點蛋白而產(chǎn)生抗COVID-19的作用。研究表明槲皮素既有抗感染活性，又有抗復(fù)制活性，在單層細胞培養(yǎng)中槲皮素可抑制多種病毒對細胞的感染，并且可以抑制病毒在細胞內(nèi)復(fù)制[15]。李海波等[16]實驗研究表明黃酮類成分異鼠李素、槲皮素及木犀草素在體外具有較強的抗甲型流感病毒的活性。本研究僅對連花清瘟顆粒中靶向SARS-CoV-2感染受體細胞的配體蛋白S蛋白進行了分子對接研究，未對其他的非質(zhì)控指標的化合物進行分析；并且由于對病毒、疾病并發(fā)癥、后遺癥的認識不足和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)本身存在的局限性，在后期實驗研究中應(yīng)加以驗證。

根據(jù)中醫(yī)理論分析，COVID-19感染的病位在肺，病因?qū)傩詾椤皾穸疽摺保瑵窭㈤]肺，使氣機升降失司[17]。由“中藥-歸經(jīng)”網(wǎng)絡(luò)模型可知，連花清瘟顆粒中13種藥材有10種歸肺經(jīng)，表明連花清瘟顆粒對肺部病變具有特異的治療作用。此外，該方中多味藥物歸脾、胃經(jīng)，表明連花清瘟顆粒還可改善脾胃升降失常所致的“濕邪”。KEGG分析得到的連花清瘟顆?？笴OVID-19的多條信號通路中，與肺部最為相關(guān)的3條通路——非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路、小細胞肺癌均包括HARS、PIK3R1和AKT1等靶點，且這些靶點是連花清瘟顆粒所含關(guān)鍵成分的作用靶點。此外，連花清瘟顆?？笴OVID-19的信號通路還涉及B細胞受體信號通路、免疫通路Toll樣受體信號通路、VEGF信號通路、MAPK樣受體信號通路等與肺損傷保護相關(guān)的通路及前列腺癌、胰腺癌及甲狀腺癌等癌癥通路，涉及PTGS2、HSP90AA1、PIK3CA、EGFR等多靶點，體現(xiàn)了連花清瘟顆粒防治COVID-19的多成分、多靶點及多途徑協(xié)同調(diào)節(jié)的優(yōu)勢。

綜上所述，本研究基于計算機輔助物設(shè)計方法對連花清瘟顆粒靶向SARS-CoV-2 S蛋白而抗COVID-19的潛在活性成分和作用機制進行了探討。同時，本研究選擇Zhou等[18]報道的SARS-CoV-2感染人體細胞的關(guān)鍵蛋白S蛋白的高分辨晶體結(jié)構(gòu)，對連花清瘟顆粒抗SARS-CoV的成分進行分子對接的虛擬篩選研究，對接結(jié)果顯示芹菜素、刺槐素、桔皮素、去甘草查耳酮、甲麻黃堿、大黃素甲醚及血清素7種成分具有靶向SARS-CoV-2 S蛋白的能力，從分子水平上初步證實了連花清瘟顆粒具有直接靶向SARS-CoV-2 S的作用及其潛在活性成分。本研究通過系統(tǒng)性、靶向性兩個角度進一步證明了連花清瘟顆粒通過多成分、多靶點、多途徑全面治療疾病的突出能力，為中醫(yī)組方的科學(xué)性和潛在療效提供了佐證，也為后續(xù)抗COVID-19的中醫(yī)遣方用藥提供了一定的理論依據(jù)。