陳虎虎， 周姣含， 邱 倩， 張小偉

(1.隴東學(xué)院岐伯醫(yī)學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；2.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 慶陽 745000；3.慶陽市第二人民醫(yī)院，甘肅 慶陽 745000)

乳腺癌是一種乳腺上皮組織惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，具有較高致死率，對(duì)女性生命健康有較大威脅[1]。目前臨床主要采取手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等方式治療乳腺癌，但整體療效不佳，且手術(shù)及放化療給患者身體帶來較大痛苦及副作用[2]，隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，近年來中藥抗癌作用研究受到廣泛關(guān)注。香芹酚是一種單萜酚類天然化合物，研究顯示其對(duì)乳腺癌發(fā)揮抗癌作用[3]。然而目前有關(guān)香芹酚對(duì)乳腺癌的抗癌作用機(jī)制尚未明確。癌細(xì)胞增殖及凋亡失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵，研究顯示，B淋巴細(xì)胞瘤-2/細(xì)胞色素C(B-cell lymphoma-2/CytC，Bcl-2/CytC)是一條線粒體凋亡通路，在癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。葉敏[7]研究顯示，抑制Bcl-2家族蛋白表達(dá)可抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)香芹酚對(duì)乳腺癌影響作用是否與調(diào)控Bcl-2/CytC通路有關(guān)尚未見報(bào)道，因此本研究探討香芹酚對(duì)人乳腺癌細(xì)胞凋亡及Bcl-2/CytC通路的影響，以期為臨床提高乳腺癌治療效果提供一定參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞系HCC1937細(xì)胞株，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 試劑與藥物 香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%，20 mg，貨號(hào)210609)購(gòu)自武漢中標(biāo)科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào)KPM150110P)、蛋白提取試劑盒(貨號(hào)SD-001)均購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)(批號(hào)30111109)、PI染料(批號(hào)75002)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)AD10-2)均購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤基因-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(貨號(hào)10195-MM01T)、CytC(貨號(hào)6370-MC-100)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)(貨號(hào)ATA25882)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(貨號(hào)FT-B3350S)；山羊抗兔HRP二抗(貨號(hào)WK355-FOV)均購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司。

1.3 儀器 BBD6220型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；HDMI3800-A型透射電鏡(深圳市西派克光學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取HCC1937細(xì)胞解凍、復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)和90%RPMI-1640的培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞分組 取“2.1”項(xiàng)下培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCC1937細(xì)胞，重懸后接種至24孔板(每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組，HCC1937細(xì)胞不做特殊處理；香芹酚低、中、高劑量組，分別加入終濃度為40、60、80 μmol/L香芹酚[8]溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 MTT法檢測(cè)各組HCC1937細(xì)胞增殖能力 取培養(yǎng)24 h的各組HCC1937細(xì)胞，重懸后接種至24孔板(每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h左右，棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO振蕩、溶解，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔細(xì)胞光密度(OD)值，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2.4 透射電鏡觀察各組HCC1937細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 取培養(yǎng)24 h的各組HCC1937細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心10 min，棄去上清后沿離心管壁緩慢加入0.25%戊二醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

2.5 PI染色檢測(cè)各組HCC1937細(xì)胞周期變化 取培養(yǎng)24 h的各組HCC1937細(xì)胞，胰酶消化，離心后收集，用PBS重懸，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過夜，離心棄上清，沖洗后PBS重懸細(xì)胞沉淀，加入50 μL/mL PI染料反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，計(jì)算各組細(xì)胞G1期、S期、G2/M期細(xì)胞所占百分比。

2.6 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組HCC1937細(xì)胞凋亡情況 取培養(yǎng)24 h的各組HCC1937細(xì)胞，PBS沖洗，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度(1×106/mL)，取100 μL加入5 μL AnnexinV-FITC及10 μL 20 μg/mL PI混勻，孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組HCC1937細(xì)胞Bcl-2/CytC通路蛋白表達(dá) 取培養(yǎng)24 h的各組HCC1937細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解20 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，檢測(cè)蛋白總量，取20 μg與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌，之后加入一抗Bax、CytC、caspase-3、內(nèi)參β-actin(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1.5 h，顯影、定影，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 香芹酚對(duì)HCC1937細(xì)胞增殖情況的影響 與空白對(duì)照組比較，香芹酚各劑量組HCC1937細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組HCC1937細(xì)胞的增殖情況

3.2 香芹酚對(duì)HCC1937細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響 空白對(duì)照組HCC1937細(xì)胞核較大且清晰，細(xì)胞器豐富，線粒體呈圓形或橢圓形形態(tài)，基質(zhì)豐富，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻；香芹酚各劑量組HCC1937細(xì)胞微絨毛脫落、細(xì)胞質(zhì)變性，線粒體內(nèi)外膜融合，縮小，線粒體嵴減少且紊亂，出現(xiàn)腫脹及空泡樣變，細(xì)胞染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核碎裂出現(xiàn)凋亡形態(tài)，并且以上HCC1937細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化呈劑量依賴性，見圖1。

圖1 各組HCC1937細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，×400)

3.3 香芹酚對(duì)HCC1937細(xì)胞周期變化的影響 與空白對(duì)照組比較，香芹酚各劑量組G0/G1期HCC1937細(xì)胞分布比例升高(P<0.05)，S期、G2/M期HCC1937細(xì)胞分布比例降低(P<0.05)，且均呈劑量依賴性，見圖2、表2。

圖2 各組HCC1937細(xì)胞周期

表2 各組HCC1937細(xì)胞周期

3.4 香芹酚對(duì)HCC1937細(xì)胞凋亡率的影響 與空白對(duì)照組比較，香芹酚各劑量組HCC1937細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖3、表3。

圖3 各組CC1937細(xì)胞凋亡

表3 各組HCC1937細(xì)胞凋亡率

3.5 香芹酚對(duì)HCC1937細(xì)胞中Bcl-2/CytC通路蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，香芹酚低、中、高劑量組Bcl-2蛋白水平降低，Bax、CytC、caspase-3蛋白水平升高，并均呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖4、表4。

圖4 各組HCC1937細(xì)胞中Bcl-2/CytC通路蛋白條帶圖

表4 各組HCC1937細(xì)胞中Bcl-2/CytC通路蛋白表達(dá)

4 討論

乳腺癌是女性最常見乳腺導(dǎo)管上皮惡性腫瘤，居女性惡性腫瘤第2位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為全世界女性因腫瘤死亡的主要原因之一[9-10]。目前手術(shù)及放化療是治療乳腺癌的主要策略，但手術(shù)給患者帶來痛苦，影響患者生活質(zhì)量，放化療藥物又使患者易產(chǎn)生耐藥性及較大副作用[11-12]，因此尋找新的有效治療方式在臨床仍較為棘手。

中藥具有副作用小、毒性低等特點(diǎn)，且越來越多研究發(fā)現(xiàn)中藥具有抗腫瘤作用[13]。香芹酚是一種單萜酚，普遍存在于天然植物揮發(fā)油中，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抑制增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，但具體機(jī)制尚不清楚。癌細(xì)胞過度增殖及凋亡受抑制在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-15]。本研究透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，香芹酚各劑量組HCC1937細(xì)胞微絨毛脫落、細(xì)胞質(zhì)變性，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞染色質(zhì)固縮，出現(xiàn)凋亡形態(tài)，且以上HCC1937細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化呈劑量依賴性。與空白對(duì)照組比較，香芹酚各劑量組細(xì)胞增殖抑制率、G0/G1期細(xì)胞分布比例、細(xì)胞凋亡率均呈劑量依賴性升高，S期、G2/M期HCC1937細(xì)胞分布比例呈劑量依賴性降低，說明香芹酚能抑制HCC1937細(xì)胞增殖，并能夠誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。王玄[3]研究顯示，香芹酚能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，與本研究結(jié)果相似。

研究表明，以線粒體為核心介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。線粒體是具有主要功能的細(xì)胞器，能夠參與能量代謝，與細(xì)胞衰老損傷有關(guān)[16-17]。Bcl-2家族在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，其家族主要包括抑制凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax等，二者通過形成同源或異源二聚體調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)信號(hào)傳遞，其中Bcl-2低表達(dá)，則Bax高表達(dá)，而Bax可以破壞線粒體膜促進(jìn)細(xì)胞中CytC的釋放，從而強(qiáng)化caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游促凋亡基因caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18-19]。張麗梅等[20]研究顯示，促進(jìn)Bcl-2/Bax/caspase-3信號(hào)通路活化可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，香芹酚各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低，Bax、CytC、caspase-3蛋白表達(dá)呈劑量依賴性升高，與既往研究結(jié)果相似，說明香芹酚可制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是通過促進(jìn)Bcl-2/CytC信號(hào)通路活化實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，香芹酚對(duì)HCC1937細(xì)胞具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用，可能是通過促進(jìn)Bcl-2/CytC線粒體凋亡通路活化實(shí)現(xiàn)的，然而本研究并未能明確Bcl-2/CytC通路在香芹酚誘導(dǎo)乳腺癌HCC1937細(xì)胞凋亡中的具體調(diào)控機(jī)制，后期應(yīng)進(jìn)一步深入闡述。