萬浩宇， 杜成昊， 何 昱， 楊潔紅， 丁志山， 周惠芬

(浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

缺血性中風已成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病[1-2]，到2030年我國每年新發(fā)患者將由現(xiàn)在的180萬例上升至540萬例。黃芪、川芎已成為益氣活血類中醫(yī)方劑(如補陽還五湯、腦心通膠囊等)的核心配伍和常用藥對，在中醫(yī)臨床上常用于治療腦血管病氣虛血瘀證，臨床療效確切[3-6]。目前，關(guān)于黃芪與川芎配伍及其中藥復方的臨床、組分、作用機理等方面已有較多研究[7-8]，但較少涉及其有效成分配伍組合。本實驗選擇黃芪、川芎有效成分黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸作為研究對象，通過原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元構(gòu)建缺氧缺糖模型，從細胞分子水平探討其配伍對缺氧缺糖致乳鼠海馬神經(jīng)元細胞損傷的保護作用及其機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷(批號SZ20170301HQJG, 純度≥98%)、阿魏酸(批號SZ20170305AWS, 純度≥98%)、川芎嗪(批號SZ20170402GXQ, 純度≥98%)、藁本內(nèi)酯(批號SZ20170318GBNZ, 純度≥98%)對照品均購自南京植萃生物科技有限公司。尼莫地平片(批號170103)購自德國拜耳公司。DMEM/F12培養(yǎng)基(杭州基諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27補充液(美國Gibco公司)；L-多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、D-Hanks液、0.25%胰酶(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法檢測試劑盒、微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FITC AnnexinV Apotosis Detection Kit(美國BD公司)；caspase-3活性檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)。

1.2 動物 出生24 h內(nèi)新生SD乳鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2008-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

1.3 儀器 倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺(上海博訊設(shè)備有限公司)；3111 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SX-500高壓滅菌鍋(日本Tommy公司)；LD25-2低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；Millipore Simplicity 純水儀(美國Millipore公司)；電熱鼓風干燥箱VBLC310(德國Heraeus公司)；Molecular Devices Spectra-MAX Plus 384酶標儀(美國MD公司)；BD FAC-Sculibar流式細胞儀(美國BD公司)；6孔細胞培養(yǎng)板、96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將乳鼠按壓椎體處死，在75%乙醇中浸泡3 min，剪開顱骨，分離大腦半球，移入裝有冰浴D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，剝離雙側(cè)海馬體，將其剪碎成大小約1 mm3的組織塊，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中消化20 min，每5 min振蕩搖勻使其完全消化，20 min后終止消化，200目篩網(wǎng)過篩，收集過篩后的細胞懸液至離心管中，1 000 r/min離心10 min，傾去上清液，用培養(yǎng)基重懸細胞，以1×105/mL的細胞密度接種于預先以多聚賴氨酸包被過的6孔板中，接種6 h后更換成飼養(yǎng)培養(yǎng)基(97% Neurobasal-A、2% B27、1%L-谷氨酰)，每3.5 d換液1次，第7天細胞成熟后，用于后續(xù)實驗。

2.2 細胞純度鑒定 多聚賴氨酸包被蓋玻片置于培養(yǎng)板中，接種海馬神經(jīng)元，制作細胞爬片，7 d后待海馬神經(jīng)元成熟后取出，滴加預冷PBS洗滌3次，預冷4%丙酮固定細胞30 min，PBS洗滌3次，滴加3%雙氧水室溫下封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，滴加PBS洗滌3次，使用0.3% Triton透化15 min，滴加PBS洗滌3次，加入10%山羊血清工作液，室溫封閉10 min，棄去山羊血清，滴加兔抗大鼠NSE多克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過夜，次日將濕盒放于37 ℃恒溫箱中復溫30 min，滴加PBS洗滌3次，加入生物素化山羊抗兔IgG二抗(1∶100)，放入恒溫箱再次孵育30 min，PBS洗滌5次，每次5 min，SABC顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞核被染成淡紫色，胞漿及突起被染成棕褐色者為海馬神經(jīng)元細胞，其它細胞則不染色。隨機觀察4個視野中細胞情況，統(tǒng)計并計算其純度。

2.3 細胞毒性測定 將原代海馬神經(jīng)元細胞密度調(diào)至1×105/mL后培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板中， 待其生長成熟后加入用飼養(yǎng)培養(yǎng)基配置成的不同劑量單體有效成分，24 h后加入MTT溶液20 μL，4 h后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，檢測各孔光密度(OD)，確定各單體有效成分細胞毒性劑量，以細胞存活率90%以上為安全給藥劑量，計算細胞存活率，確定其高、中、低劑量，并按照正交設(shè)計4因素3水平原則分成9組。

2.4 缺氧缺糖模型建立 取含有形態(tài)成熟的乳鼠海馬神經(jīng)元的6孔培養(yǎng)板，將其分成12組，分別為正常組、模型組、陽性對照(尼莫地平)組(200 μg/mL)、配伍組(9組)，吸棄培養(yǎng)板中原培養(yǎng)基，使用無糖Earle’s培養(yǎng)液清洗3次，除正常組、模型組加不含藥物的無糖Earle’s培養(yǎng)液1 mL外，其余各組加入含有相應(yīng)藥物的無糖Earl’s培養(yǎng)液1 mL，放入造模盒中(除正常組外)，充滿混合氣(95% N2、4% CO2、1% O2)，將造模盒移入37 ℃恒溫箱中放置3 h，取出各組培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.5 海馬神經(jīng)元凋亡情況檢測 多聚賴氨酸包被蓋玻片放于12孔培養(yǎng)板，將海馬神經(jīng)元接種于其上制作細胞爬片，7 d后細胞爬片上海馬神經(jīng)元成熟時，按“2.4”項下方法分組，吸棄原培養(yǎng)基，PBS清洗2次，除正常組、模型組加入不含藥物的無糖Earle’ s培養(yǎng)液1 mL外，其余各組加入含相應(yīng)藥物的無糖Earle’s培養(yǎng)液1 mL，除正常組外均進行缺氧缺糖處理，處理完畢后棄去培養(yǎng)板中液體，PBS清洗，預冷的4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，滴加PBS清洗1次，加入Hoechst 33342熒光染料10 mg/L，恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min，在熒光倒置顯微鏡下觀察，以紫外光激發(fā)查看細胞染色結(jié)果。

2.6 SOD、LDH、GSH-Px活性與NO水平檢測 取細胞上清液，檢測各組LDH活性。按照試劑盒說明書，檢測細胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性及NO水平。

2.7 早期凋亡率檢測 取海馬神經(jīng)元適量，按“2.4”項下方法分組，消化收集細胞，1×Binding buffer緩沖液重懸細胞，調(diào)整為3×105/mL的細胞懸液，取100 μL加到Falcon試管中，加AnnexinV- FTTC/ PI 500 μL，室溫置于暗處避光15 min，滴加1×Binding buffer緩沖液400 μL，流式細胞儀檢測海馬神經(jīng)元早期凋亡，計算海馬神經(jīng)元早期凋亡率。

2.8 海馬神經(jīng)元caspase-3活性檢測 取海馬神經(jīng)元適量，按“2.4”項下方法分組，按照說明書操作步驟檢測caspase-3活性。

3 結(jié)果

3.1 海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)及NSE純度 接種12 h后，細胞形狀不規(guī)則，有細小突觸，部分已貼壁生長,見圖1A。培養(yǎng)至第7天時，胞體飽滿清晰，立體感明顯，折光性變強，突起分支增多，互相交織形成明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖1B。經(jīng)檢測，細胞純度大于90%，可用于后續(xù)實驗，見圖2。

圖1 海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)(×100)

3.2 細胞安全劑量與配伍分組 采用MTT法，測得尼莫地平、黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、川芎嗪非細胞毒性劑量分別為200、10、10、40、400 μg/mL，再按照表1中的正交設(shè)計進行配伍分組。另外，選擇細胞存活率最高的200 μg/mL尼莫地平作為陽性對照組。

表1 正交設(shè)計配伍分組(μg/mL)

3.3 缺氧缺糖下海馬神經(jīng)元細胞形態(tài) 如圖3所示，與正常組比較，模型組胞質(zhì)腫大，折光性下降，胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡與凋亡小體，突起縮短斷裂，細胞脫壁現(xiàn)象明顯；與模型組比較，4個配伍組胞質(zhì)腫脹變大現(xiàn)象減輕，折光性較為明顯，突起斷裂現(xiàn)象減輕，胞體中空泡及散在凋亡小體減少。

圖3 缺氧缺糖下各組海馬神經(jīng)元形態(tài)

3.4 海馬神經(jīng)元細胞Hoechst 33342染色形態(tài) 如圖4所示，正常組細胞形態(tài)完整，染色均勻，胞體發(fā)出均勻的淡藍色熒光；與正常組比較，模型組細胞熒光光度增強，胞體內(nèi)可見大量亮藍色點狀或碎片狀熒光，細胞核染色較為致密，提示細胞損傷凋亡較嚴重；與模型組比較，配伍組細胞染色均勻，熒光亮度有不同程度的降低，少部分發(fā)出亮藍色熒光，胞體內(nèi)亮藍色點狀或碎片狀熒光數(shù)量較少。

3.5 配伍對海馬神經(jīng)元細胞SOD、LDH、GSH-Px活性及NO水平的影響 如表2所示，與正常組比較，模型組NO水平、LDH活性升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型組比較，配伍組、陽性對照組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低NO水平，抑制LDH活性(P<0.05，P<0.01)。

表2 配伍對海馬神經(jīng)元細胞SOD、GSH-Px活性、NO水平及LDH漏出量的影響

3.6 配伍對海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率及caspase-3活性的影響 如表3所示，與正常組比較，模型組細胞早期凋亡率、caspase-3活性升高(P<0.01)；與模型組比較，配伍組和陽性對照組細胞早期凋亡率、caspase-3活性降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 配伍對海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率及caspase-3活性的影響

3.7 直觀分析 如表4～5所示，有效成分對SOD活性的影響程度依次為黃芪甲苷>藁本內(nèi)酯>川芎嗪、阿魏酸，較優(yōu)組合為A3B1C3D2；對GSH-Px活性的影響程度依次為黃芪甲苷>川芎嗪>藁本內(nèi)酯>阿魏酸，較優(yōu)組合為A2B2C3D1；對NO水平的影響程度依次為川芎嗪>黃芪甲苷>阿魏酸>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A1B1C1D1；對LDH活性的影響程度依次為黃芪甲苷>阿魏酸>川芎嗪>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A3B3C2D1；對caspase-3活性的影響程度依次為川芎嗪>阿魏酸>黃芪甲苷>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A2B1C2D3；對細胞早期凋亡率的影響程度依次為川芎嗪>黃芪甲苷>阿魏酸>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A2B1C2D3。

3.8 綜合平衡法

3.8.1 川芎嗪 川芎嗪對NO水平、caspase-3活性及海馬神經(jīng)元細胞早期凋亡率都是影響最顯著的因素。對caspase-3活性、細胞早期凋亡率，取A2水平為宜；對其他指標而言，川芎嗪極差并非最大，選擇A2水平即可。綜合考慮，選擇A2水平。

3.8.2 黃芪甲苷 黃芪甲苷對SOD、LDH、GSH-Px活性都是影響最顯著的因素，而對NO水平、細胞早期凋亡率的影響程度僅次于川芎嗪。對GSH-Px、LDH、caspase-3活性及細胞早期凋亡率，取B2水平為宜；對于SOD活性、NO水平，取B1水平為宜，B2則次之。綜合考慮，選擇B2水平。

3.8.3 阿魏酸 阿魏酸對SOD、GSH-Px活性及NO水平的影響程度最小，對LDH、caspase-3活性及細胞凋亡率，取C2水平為宜；對GSH-Px活性、NO水平，取C1水平為宜；對SOD活性，取C3水平較好。綜合考慮，選擇C2水平。

3.8.4 藁本內(nèi)酯 對SOD活性、NO水平、細胞早期凋亡率、caspase-3活性，取D2水平為宜；對GSH-Px、LDH活性，藁本內(nèi)酯影響程度不明顯，取D2水平即可。綜合考慮，選擇D2水平。

3.8.5 最優(yōu)配伍 最優(yōu)配伍方案為A2B2C2D2，即川芎嗪200 μg/mL，黃芪甲苷5 μg/mL，阿魏酸20 μg/mL，藁本內(nèi)酯5 μg/mL。

4 討論

缺血缺氧性腦病的病理損傷機理極其復雜，其中氧自由基連鎖反應(yīng)損傷是其重要的核心機制之一[9-10]。通過對細胞中SOD、GSH-Px活性與NO水平進行檢測，能夠反映出機體缺氧狀態(tài)下的損傷程度，同時評估藥物治療效果，預估預后狀況[11]。當機體缺氧，腦細胞損傷時，LDH開始溢出細胞外，LDH溢出越多，細胞損傷越重。因此LDH活性能夠靈敏反映機體缺氧損傷程度的，是反映細胞損傷的重要指標。

細胞凋亡是導致腦缺血缺氧損傷的核心機制之一[12-13]，caspase-3活性檢測、形態(tài)學檢測及流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡率是常用的重要手段[14]。腦缺血缺氧發(fā)生后，細胞線粒體膜受到損傷，通透性破壞，水分子內(nèi)流使線粒體毒性腫脹，細胞色素C分泌釋放增多，caspase-3被大量激活，使細胞走向凋亡[15]。Hoechst 33342熒光染色將凋亡細胞中的細胞核濃染、胞漿濃縮及細胞出泡現(xiàn)象，是一種理想的檢測方法。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡能夠多個角度分析細胞凋亡。AnnexinV/PI雙染色法依據(jù)細胞凋亡時會出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸外翻現(xiàn)象與AnnexinV對PS高親和性、PI對早期細胞拒染性等特性對凋亡細胞進行檢測。

本研究表明，與正常組比較，缺氧缺糖模型組能夠?qū)ｑR神經(jīng)元細胞造成嚴重的損傷，能夠抑制SOD、GSH-Px活性，提高NO水平與LDH活性，激發(fā)細胞內(nèi)部caspase-3活性，加重海馬神經(jīng)元早期凋亡。與模型組比較，黃芪、川芎四種有效成分正交設(shè)計配伍組能夠不同程度地提高SOD、GSH-Px活性，減少NO水平與LDH活性，抑制caspase-3活性與細胞早期凋亡，其中黃芪甲苷能夠顯著增強機體抗氧化能力，而川芎嗪則抑制細胞早期凋亡率。通過極差分析法，較好配伍組合為A2B2C2D2。本研究對黃芪、川芎2味中藥重要有效成分的組分配伍對于缺氧缺糖狀態(tài)下的乳鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用及機制進行初步探討，并找出優(yōu)勢配伍比例，為黃芪川芎的臨床配伍應(yīng)用提供思路。