胡旭紅， 伍林澤， 魏義杰， 傅榕冰， 黃 豐， 童曉云， 趙 茜， 李嘉瑩，虎春艷， 吳向農(nóng)， 聶 堅， 魏丹霞*

(1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.騰沖市中醫(yī)醫(yī)院，云南 騰沖 679100；3.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；4.云南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種常見多發(fā)病，已成為全球性的社會衛(wèi)生問題。哮喘癥狀包括氣喘、呼吸困難、胸悶和咳嗽，都是由于氣流受阻引發(fā)的炎癥及氣道平滑肌收縮和粘液纖毛清除受損所共同引起的[1]，因此，病理黏液的形成是哮喘發(fā)病率和死亡率的一個重要因素[2]，氣道黏液的主體成分是黏蛋白，是由氣道上皮杯狀細胞和黏膜下層黏液細胞分泌的糖蛋白，通過肺活檢及誘導痰檢測證實了哮喘患者氣道中增多的主要黏蛋白為MUC5AC[3]。在正常生理情況下，黏蛋白參與了呼吸道黏液的組成，可以保護和潤滑氣道上皮，而在病理情況下，一些炎癥介質(zhì)參與了氣道重塑的發(fā)展，包括Th2型細胞因子。Th17細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞的一個亞型，可以通過分泌IL-17發(fā)揮強大的促炎作用誘發(fā)炎性介質(zhì)的釋放，引起組織損傷等一系列炎癥反應(yīng)，其次，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)也參與了哮喘的發(fā)生過程，它能避免免疫反應(yīng)過度，減輕對機體的損傷[4]。

清熱潤燥口服液為云南省名老中醫(yī)陸家龍30年的經(jīng)驗方基礎(chǔ)上經(jīng)現(xiàn)代工藝加工而成，由桑葉、杏仁、沙參、麥冬等13味中藥組成，全方取《溫病條辨》“桑杏湯”“沙參麥冬湯”之辛涼甘潤以生津液、養(yǎng)肺胃達“潤養(yǎng)”之力，取《備急千金要方》“葦莖湯”以清肺脾郁熱使燥化之痰熱從肺、腸“通利”而出，養(yǎng)潤與通利并行，共奏清熱養(yǎng)陰，潤燥止咳，運脾化痰利濁之效。在前期昆明市科技計劃項目中(2013-04-02-A-S-02-2142)，經(jīng)動物實驗證實其具有祛痰、止咳、平喘、免疫及抗炎作用[5-7]。因此，推測清熱潤燥口服液可能通過降低Th2型細胞因子的水平以抑制MUC5AC的生成，以及維持Treg/Th17細胞之間的平衡，抑制趨化因子和炎癥因子的水平從而在卵清蛋白(OVA)致敏的哮喘小鼠模型中發(fā)揮改善氣道慢性炎癥的作用。

1 材料

1.1 動物 40只清潔級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2015-0001。

1.2 試劑與儀器 地塞米松(批號BCBV3214)、Ⅴ級卵清蛋白(批號9006-59-1)均購自美國Sigma公司；納米級氫氧化鋁粉末(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號38701)；MCP-1(批號A28781123)、IL-17A(批號A21780741)、IL-10(批號A21080946)、IL-9(批號A20980513)、IL-13(批號A21381132)、IgE(批號A27581115) ELISA試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；IL-8 ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，批號M181106-104a)；OVA-IgE ELISA試劑盒(美國Cayman公司，批號500840)；MUC5AC ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號ZKVBMELGV3)。超聲霧化儀(德國百瑞公司，型號INQUA NEB plus)；多功能酶標儀(倍捷科技有限公司，型號AR224CN)；臺式高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司，型號HR/T16 M)；脫水機(型號JJ-12J)、包埋機(型號JB-P5)均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016)；成像系統(tǒng)(日本尼康公司，型號NIKON DS-U3)。

2 方法

2.1 分組 將40只小鼠隨機分為正常組、模型組、地塞米松組(1 mg/kg)、清熱潤燥口服液低劑量組(4.32 g/kg)、清熱潤燥口服液高劑量組(8.64 g/kg)，每組8只，分籠飼養(yǎng)，均在相同環(huán)境(12 h/12 h明暗交替，相對濕度20%～30%及自由飲食飲水)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2.2 藥液制備 組方藥材桑葉200 g、蘆根300 g、苦杏仁120 g、南沙參240 g、麥冬200 g、浙貝母200 g、薏苡仁300 g、冬瓜仁300 g、陳皮60 g、茯苓200 g、京半夏200 g、炒谷芽300 g、炒麥芽300 g，均購自云南中醫(yī)藥大學校醫(yī)院，并委托制劑室制成生藥量3.94 g/mL的原液，保存于4～8 ℃冰箱中備用，使用前用超純水配制為不同劑量藥液。根據(jù)前期實驗結(jié)果[5-7]，將高、低劑量分別設(shè)定為8.64、4.32 g/kg，方中原藥材選擇均按2020年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定加工炮制成合格飲片，對主要有效成分進行質(zhì)量控制，采用薄層監(jiān)控各中藥的TLC斑點，HPLC法測定主要成分含量[8-11]。

2.3 建模及給藥 按照文獻[12]方法并進行了改進，于實驗第1、8、15天，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水(10 mL/kg)，其余各組腹腔注射OVA混懸液(1 mg/mL OVA+5 mg/mL氫氧化鋁)致敏，劑量均為0.25 mL。于實驗第21～27天，稱取并記錄各組小鼠體質(zhì)量，在霧化激發(fā)前1 h，正常組、模型組給予生理鹽水(10 mL/kg)灌胃，其余各組分別給予對應(yīng)藥物；除正常組用生理鹽水外，其他各組均用2% OVA霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min，持續(xù)1周。

2.4 體征及行為學變化觀察 當小鼠體質(zhì)量減輕，出現(xiàn)煩躁不安、持續(xù)撓腮抓耳、全身節(jié)律性收腹樣喘促時，表示支氣管哮喘模型建立成功。

2.5 引喘潛伏期記錄 在霧化激發(fā)后3 d，每天從霧化開始計時，發(fā)現(xiàn)小鼠躁動不安、抓耳撓腮、呼吸急促、在通風小孔處堆積的情況，此時即為引喘潛伏期。觀察時間為前8 min，以秒為單位計算，并以3 d記錄時間的平均值為結(jié)果。

2.6 血清收集 于實驗第28天，每只小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1 h后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，上清液分裝并保存在-80 ℃低溫冰箱中。

2.7 肺泡灌洗液采集 將取血后的小鼠用乙醇擦拭腹部，打開胸腔，將右支氣管夾閉，于主支氣管上開一V型口，將帶有毛細管的注射器插入左支氣管后結(jié)扎以防止脫離，注入0.3 mL PBS緩沖液，緩慢平穩(wěn)抽吸3次，反復進行2次灌洗，以總回收率70%以上為合格。肺泡灌洗液4 ℃、2 000 r/min離心5 min，上清液分裝后，保存在-80 ℃冰箱中。

平面幾何負擔著培養(yǎng)和發(fā)展學生空間想象能力的基本任務(wù)，以平面幾何為契機，逐步深入學習研究解析幾何、代數(shù)、三角數(shù)形結(jié)合（例如：數(shù)軸、坐標、函數(shù)圖象等），立體幾何等，無論哪一部分數(shù)學知識都必須由教師有效控制課堂活動。新課程需要新方法，采用先學后教，讓學生“從書中學”、“從做中學”，教師重視講授學生學不會的，又重視練習、既重基礎(chǔ)又重能力、有明確的知識技能掌握和練習目標的開放的教學方法。

2.8 小鼠血清及BALF中細胞因子水平檢測 采用ELISA法檢測BALF中IL-13、IL-9、MUC5AC、IL-17A、IL-10、IL-8、MCP-1水平，以及血清中IgE、OVA-IgE水平，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書中的操作步驟進行。

2.9 小鼠BALF中白細胞數(shù)目檢測 取10 μL BALF下層細胞懸液，用細胞計數(shù)板在倒置顯微鏡下計數(shù)，計算細胞懸液中細胞總數(shù)。取20 μL細胞懸液，于玻片上制成細胞涂片，按照快速瑞氏-吉姆薩染色說明書的操作進行白細胞、單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)量的計算，所得比例乘以細胞總數(shù)即為各類細胞的數(shù)目。

2.10 小鼠肺組織黏蛋白分泌檢測 取小鼠右肺中葉組織，生理鹽水清洗后用濾紙吸干(注意不能破壞組織)，置于4%組織固定液中固定24 h，石蠟包埋，PAS染色，觀察小鼠氣管周圍黏液分泌情況。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠引喘潛伏期的比較 與正常組比較，模型組小鼠引喘潛伏期縮短(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組和清熱潤燥口服液各劑量組小鼠引喘潛伏期均延長(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠引喘潛伏期比較

3.2 小鼠BALF中各類細胞數(shù)目比較 與正常組比較，模型組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞增加(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組和清熱潤燥各劑量組小鼠BALF中各類細胞數(shù)均減少(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠BALF中白細胞總數(shù)及各類細胞總數(shù)比較

3.3 小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平 如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組和清熱潤燥口服液各劑量組小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平均降低(P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖1 清熱潤燥口服液對小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平的影響

圖2 清熱潤燥口服液對小鼠肺組織黏液分泌的影響(PAS染色，×200)

3.5 小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組及清熱潤燥口服液各劑量組小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平均降低(P<0.01)。

3.6 小鼠BALF中IL-17A、IL-10水平 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中IL-17A水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組及清熱潤燥口服液各劑量組小鼠BALF中IL-17A水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖3 清熱潤燥口服液對小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平的影響

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 清熱潤燥口服液對小鼠BALF中IL-17A、IL-10水平的影響

3.7 小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平 如圖5所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組及清熱潤燥口服液各劑量組小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平降低(P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖5 清熱潤燥口服液對小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平的影響

4 討論

氣道黏液主體成分黏蛋白由氣道上皮杯狀細胞分泌，目前已有21種黏蛋白在人類基因組中被發(fā)現(xiàn)。在正常人的氣道內(nèi)，MUC5B是分泌型黏蛋白的主要成分，MUC5AC水平較少，病理情況下則以MUC5AC為主[13]。因此，抑制MUC5AC的高分泌，可以有效地改善哮喘患者癥狀，并減少病死率。本研究提示清熱潤燥口服液可以降低血清MUC5AC水平。

IL-9是一種由CD4+細胞亞群(稱為Th9細胞)釋放的多效性Th2細胞因子，在小鼠模型中，IL-9刺激粘蛋白轉(zhuǎn)錄和杯狀細胞增生，它還誘導氣道上皮細胞產(chǎn)生IL-13[14-15]，說明IL-13在促進氣道杯狀細胞增生過程中起到關(guān)鍵作用，是促進氣道炎癥和黏液分泌的重要細胞因子。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠在接受清熱潤燥口服液干預(yù)后，IL-9和IL-13水平降低，氣道內(nèi)的黏液高分泌減少，提示清熱潤燥口服液可能通過抑制IL-9、IL-13的生成和相互作用，從而抑制了大量的杯狀細胞增生和氣道黏液的高分泌，以此減輕哮喘癥狀。

目前，隨著研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，過敏性疾病與免疫球蛋白E(IgE)水平密切相關(guān)，IgE也是氣道過敏反應(yīng)的核心，而減少氣道過敏反應(yīng)是控制過敏性哮喘的關(guān)鍵[16-17]。研究顯示，IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE高親和力受體FcεRⅠ結(jié)合形成FcεRⅠ-IgE復合物，而低親和力受體FcεRⅡ與IgE特異性結(jié)合形成FcεRⅡ-IgE復合物，當過敏原首次進入機體時，漿細胞受到刺激分泌大量IgE，這些IgE分子將自身的Fc端附著于嗜堿性粒細胞或肥大細胞表面，隨即發(fā)生致敏反應(yīng)[18]。從本實驗結(jié)果可見，清熱潤燥口服液可能通過抑制小鼠體內(nèi)總IgE、OVA-IgE的表達起到抑制哮喘小鼠氣道炎癥的作用。

在過去的哮喘研究中認為Th1/Th2細胞失衡在哮喘發(fā)病機制中一直具有主導作用，但目前有部分文獻報道表明Th17細胞和Treg細胞平衡可能是哮喘發(fā)病機制中的重要原因，其分泌的細胞因子IL-17A、IL-10在哮喘中占有重要作用[19]。Th17細胞分泌的主要效應(yīng)細胞因子IL-17A，它是T細胞誘導炎癥反應(yīng)的早期啟動因素，是一種強大的促炎細胞因子[20]。Treg細胞為一類調(diào)控機體免疫功能的細胞群，其作用機制主要通過分泌細胞因子IL-10直接介導免疫抑制，IL-10具有抗炎作用，既可抑制促炎細胞因子的合成，亦可抑制嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞及肥大細胞的致炎效應(yīng)[21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哮喘發(fā)生的過程中，與正常組比較，模型組IL-17 A水平升高，與之相反的是IL-10水平呈降低趨勢，而藥物組IL-17A水平降低、而IL-10水平升高，提示清熱潤燥口服液可能通過抑制Th17細胞釋放IL-17A并促進Treg細胞釋放IL-10來發(fā)揮抗炎作用。

趨化因子家族分為兩個亞家族，CXC家族和CC家族，其中，IL-8屬于CXC家族，單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-l，MCP-1)屬于CC趨化因子，IL-8可誘導中性粒細胞遷移至炎癥部位[22]。而MCP-1則主要誘導單核細胞、T細胞和嗜堿性粒細胞并誘導組胺釋放。本研究結(jié)果顯示，清熱潤燥口服液能降低BALF中白細胞總數(shù)、單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量，且BALF中IL-8、MCP-1水平也均降低，由此可以看出，清熱潤燥口服液可能通過對單核巨噬細胞，嗜中性粒細胞趨化因子的不同程度抑制從而降低單核細胞、嗜中性粒細胞在炎癥部位的聚集，減輕氣道高反應(yīng)性，改善哮喘癥狀，縮短哮喘小鼠的引喘潛伏期。

綜上所述，清熱潤燥口服液可能通過調(diào)控Th17/treg平衡，干預(yù)趨化因子的釋放、炎性細胞的聚集以及氣道黏液的高分泌來發(fā)揮治療哮喘作用。