何艷新， 田 樂， 吉 聰， 王穎航， 潘 志*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞的異常增殖，形成血管翳而導(dǎo)致滑膜炎癥及進(jìn)行性骨和關(guān)節(jié)破壞，滑膜成纖維細(xì)胞是病理變化過(guò)程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，在發(fā)病中起著重要作用[1-3]。目前，尚無(wú)治愈類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，以非甾體抗炎藥及慢性抗風(fēng)濕藥為主，但起效慢，不良反應(yīng)大，生物制劑價(jià)格昂貴，大多數(shù)患者無(wú)法長(zhǎng)期使用[4]?，F(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，同時(shí)具有不良反應(yīng)少、對(duì)肝臟損害較小等優(yōu)勢(shì)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療上具有一定優(yōu)勢(shì)[5]。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯源自《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸按5∶1比例組成，方中黃芪大補(bǔ)脾肺之氣，當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，二者合用，氣血雙補(bǔ)[6]，全方具有抗炎、補(bǔ)氣生血、調(diào)節(jié)免疫等作用[7-8]，并且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其有效成分黃芪甲苷、阿魏酸等對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(human fibroblast-like synoviocytes，HFLS-RA)增殖及相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響，探討該方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制，為相關(guān)研究提供新途徑。

1 材料

1.1 藥物 雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020415，批號(hào)20190520)。當(dāng)歸、黃芪購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市宏檢大藥房，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)蔡廣知副教授鑒定為正品。

1.2 細(xì)胞與動(dòng)物 HFLS-RA細(xì)胞購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，取3～7代用于實(shí)驗(yàn)。清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉)2011-0004，飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%。

1.3 試劑及儀器 H-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)AE26287263)；MTT(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)M8180)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(美國(guó)Pepro Tech公司，批號(hào)300-01A-10)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)ELISA試劑盒(批號(hào)CK-E10113H)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)ELISA試劑盒(批號(hào)CK-E10155H)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(批號(hào)CK-E10140H)、白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)ELISA試劑盒(批號(hào)CK-E10082H)(上海優(yōu)選生物科技有限公司)；PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)DP419)；GAPDH抗體(批號(hào)AP0063)、叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(fork-head box p3，F(xiàn)oxp3)抗體(批號(hào)BS90536)、轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)(批號(hào)AP0365)(美國(guó)Bioworld公司)；維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan nuclear receptor γ t，ROR-γt)抗體(批號(hào)bs-23019R)、Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。離心機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)DM0412)；恒溫箱(上海和呈儀器制造有限公司，型號(hào)DHG-9000/5A)；基因擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)ETC811)；熒光倒置顯微鏡(上海比目?jī)x器有限公司，型號(hào)BFM-800E)；培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，型號(hào)MCO-18AIC)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)SW-CJ-2D)；電泳儀(型號(hào)165-8000)、轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)170-3930)(美國(guó)Bio-Rad公司)；智能成像系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)FL1000)。

2 方法

2.1 含藥血清制備 42只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、模型組、雷公藤多苷組及當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組，每組7只。當(dāng)歸補(bǔ)血湯按原方黃芪-當(dāng)歸5∶1配伍比稱取藥材，煎煮濃縮至水煎液含生藥1.5 g/mL，即當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組，同法制備當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、低劑量水煎液，在4 ℃下保存?zhèn)溆?。按人與動(dòng)物體表面積換算得出，灌胃給藥劑量分別為15、7.5、3.75 g/kg，雷公藤多苷給藥劑量為每天6.25 mg/kg[9]，灌胃給藥，每天2次，7 d后腹主動(dòng)脈采血，收集血清，56 ℃滅活，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 細(xì)胞隨機(jī)分為6組，即空白組(10%空白大鼠血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞)、模型組(20 ng/mL TNF-α+10%空白組大鼠血清培養(yǎng)基)、雷公藤多苷組(20 ng/mL TNF-α+10%雷公藤多苷組大鼠血清培養(yǎng)基)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組(20 ng/mL TNF-α+10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組大鼠血清培養(yǎng)基)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組(20 ng/mL TNF-α+10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組大鼠血清培養(yǎng)基)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組(20 ng/mL TNF-α+10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組大鼠血清培養(yǎng)基)。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度至1×105/mL。將每孔200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板上，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、給藥，24 h后每孔加入20 μL MTT，4 h后每孔加入150 μL DMSO，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)。

2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β水平 按“2.2”項(xiàng)下方法分組和給藥，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清，離心，在-20 ℃下保存，按照說(shuō)明書操作步驟檢測(cè)目標(biāo)因子水平。

2.5 PCR法檢測(cè)細(xì)胞中Foxp3、ROR-γt、STAT3 mRNA表達(dá) 提取總RNA，檢測(cè)其純度、濃度、完整性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為42 ℃ 50 min，70 ℃ 10 min，再配制50 μL體系擴(kuò)增，條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s(循環(huán)39次)，72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，平行3次，檢測(cè)目的基因、內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)灰度值，兩者比值即為目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Foxp3、ROR-γt、STAT3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，制膠(12%分離膠、5%濃縮膠)，上樣后以SDS-PAGE電泳法分離蛋白樣品(80 V、30 min跑上層膠，110 V、90 min跑下層膠)，電泳結(jié)束后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜(100 V、100 min)，5%脫脂奶粉封閉1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，4 ℃下孵育一抗(GAPDH 1∶2 500，F(xiàn)oxp3 1∶500，ROR-γt 1∶500，STAT3 1∶500)過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次10 min，室溫?fù)u床上孵育二抗(1∶1 000)1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL化學(xué)發(fā)光，蛋白凝膠電泳成像儀中進(jìn)行成像，計(jì)算灰度值。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HFLS-RA細(xì)胞增殖抑制作用 與空白組比較，模型組HFLS-RA細(xì)胞增殖增加(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯各劑量組HFLS-RA細(xì)胞增殖抑制(P<0.01)，見表2。

表2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HFLS-RA增殖抑制作用

3.2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HFLS-RA細(xì)胞上清液中IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10水平的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-17水平升高(P<0.01)，TGF-β、IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-17水平降低(P<0.01)，TGF-β、IL-10水平升高(P<0.01)；與雷公藤多苷組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組細(xì)胞上清液中IL-6水平降低(P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組HFLS-RA細(xì)胞上清液中IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10水平比較

3.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HFLS-RA細(xì)胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞中ROR-γt、STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，F(xiàn)oxp3表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高劑量組細(xì)胞中ROR-γt、STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，見圖1。

注:A為蛋白印跡圖，B為蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖1 各組HFLS-RA細(xì)胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3蛋白表達(dá)

3.4 當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HFLS-RA細(xì)胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3 mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞中ROR-γt、STAT3 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，F(xiàn)oxp3 mRNA降低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組細(xì)胞中ROR-γt、STAT3 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)；與雷公藤多苷組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組細(xì)胞中ROR-γtmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見表4、圖2。

圖2 各組HFLS-RA細(xì)胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3 mRNA表達(dá)

表4 各組HFLS-RA細(xì)胞中ROR-γt、STAT3及Foxp3 mRNA表達(dá)比較

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征在于關(guān)節(jié)腫脹、壓痛，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致殘疾，潛在病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。成纖維樣滑膜細(xì)胞(HFLS-RA)是血管翳-軟骨連接處最常見的細(xì)胞類型，可產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)降解分子遷移并侵入關(guān)節(jié)軟骨來(lái)破壞關(guān)節(jié)，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的整個(gè)過(guò)程[10-11]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知，T細(xì)胞亞群在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理演變中起著非常重要的作用，其分泌的細(xì)胞因子也與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有免疫調(diào)節(jié)、造血、抗氧化、抗疲勞等多種藥理作用[12]。本課題組結(jié)合前期研究，以HFLS-RA為對(duì)象，探當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。

目前，調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞17(helperTcells17，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)平衡已成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的新途徑及新的研究熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞可導(dǎo)致自身免疫性疾病，但Treg細(xì)胞可抑制自身免疫性疾病，兩者在功能和分化過(guò)程中相互影響，相互拮抗。Th17細(xì)胞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的主要參與者，它可產(chǎn)生IL-17、IL-22和IL-23，招募中性粒細(xì)胞，促進(jìn)感染部位的炎癥；Treg細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子IL-10和TGF-β，抑制多種免疫細(xì)胞的活性[13]。STAT3在T細(xì)胞抗原受體(TCR)/共刺激信號(hào)刺激下，與TGF-β和IL-6一起被激活[14-15]，然后STAT3誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子RAR相關(guān)孤兒受體(ROR)-γt的表達(dá)，將細(xì)胞引向Th17亞群[16]，如果能夠抑制STAT3的表達(dá)等同于抑制ROR-γt的表達(dá)，則能減少Th17細(xì)胞數(shù)量。Treg細(xì)胞是由TCR刺激而產(chǎn)生的，導(dǎo)致Foxp3表達(dá)增加，Treg細(xì)胞數(shù)量增多，此外TGF-β在體外也能誘Foxp3+Treg細(xì)胞[17]。因此，調(diào)節(jié)影響和維持多種因素對(duì)于Th17/Treg的平衡、抑制炎癥反應(yīng)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展有著非常重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)HFLS-RA細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，IL-6、IL-17水平及ROR-γt、STAT3mRNA和蛋白表達(dá)降低，TGF-β、IL-10水平及Foxp3mRNA和蛋白表達(dá)升高。由此認(rèn)為，當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥具有抑制作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg，維持正常的免疫平衡來(lái)發(fā)揮作用。