齊平平， 徐祖清， 金 華

(1.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518000；3.延邊大學附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000)

隨著移植手術的開展，缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)導致的危害越來越嚴重，逐漸受到人們的關注[1]。腎缺血再灌注損傷是指腎臟在短時間缺血后重新獲得血液灌注，腎臟組織和細胞損傷沒有得到緩解反而進一步加重的現(xiàn)象，為腎移植過程中的主要病理生理過程[2]，炎癥反應及凋亡在其發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，抑制腎缺血再灌注損傷中炎癥反應與凋亡是減輕該病的重要手段[3]。蘆薈素是蘆薈主要有效成分，具有抗炎、抗衰老、抗菌、抗氧化等多種作用[4]，對心、腦缺血再灌注損傷均具有保護作用[5-6]。本研究觀察蘆薈素對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用，并探討它與炎癥反應及凋亡的關系，以期為相關臨床防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 Wistar大鼠60只，SPF級，雄性，體質量280～320 g，購于上海菲諾克生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2018-0005，自由飲水進食，相對濕度50%～60%，溫度20～25 ℃，置于通風良好的環(huán)境中飼養(yǎng)。動物實驗通過延邊大學動物倫理委員會審批(YBU-2017-045)。

1.2 試劑與藥物 蘆薈素(批號2020031601)，純度99%，購自湖北實順生物科技有限公司。尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)檢測試劑盒購自上海紀寧實業(yè)有限公司(批號JN5173、JN5522)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6檢測試劑盒購自江蘇江萊生物技術有限公司(批號JL45594、JL20884、JL20896)；TUNEL組織凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(批號C1091)；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號10296010)；逆轉錄試劑盒及SYBR實時定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號K1691、4432346)；兔源B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X，Bax)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)、β肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(一抗)購自英國Abcam公司(批號ab196495、ab53154、ab182651、ab8805、ab38449、ab8227)；羊抗兔IgG抗體(二抗，辣根過氧化物酶標記)購自北京中杉金橋生物技術有限公司(批號ZB-2306)。

1.3 儀器 7600全自動生化分析儀(日本日立公司)；RM2126切片機、JB-L5包埋機(德國徠卡公司)；CX21顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Mithras LB943酶標儀(北京科瑞恩特科技有限公司)；CFX96實時定量PCR儀(美國伯樂公司)；DYC-SCZ7蛋白電泳儀、DYC-ZY2蛋白轉印儀(北京東方瑞利科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 60只大鼠隨機分為假手術組，模型組，蘆薈素低、中、高劑量組，假手術組、模型組大鼠腹腔注射生理鹽水，蘆薈素各劑量組大鼠腹腔注射25、50、100 mg/kg蘆薈素，連續(xù)7 d。

2.2 模型建立 采用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側腎蒂法制備[7]。各組大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，在大鼠腹正中處用手術剪刀剪2 cm切口，使雙側腎蒂完全暴露，無創(chuàng)動脈夾夾閉30 min，可見大鼠腎臟顏色從鮮紅逐漸變?yōu)樽虾?，隨后松開無創(chuàng)動脈夾使腎臟血流恢復灌注，可見大鼠腎臟顏色從紫黑逐漸變?yōu)轷r紅。腹正中處切口用絲線縫合；假手術組大鼠不進行夾閉及再灌注操作，其余操作相同。術后各組大鼠自由飲水進食，不再給予蘆薈素處理。

2.3 大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測

手術后24 h，大鼠腹主動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，其中BUN水平檢測采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法，Scr水平檢測采用肌氨酸氧化酶法，TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.4 HE染色 腹主動脈取血后處死大鼠，無菌操作剖取雙側腎臟組織，置于4%多聚甲醛中固定72 h，石蠟包埋，切片機切成4 μm薄片，行常規(guī)HE染色，檢測蘆薈素對腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟病理損傷的影響。參照文獻[8]報道的方法分析蘆薈素對大鼠腎臟病理損傷的影響，其中重度損傷(炎性細胞大片浸潤，>75%的腎小管損傷)計為4分，中度損傷(炎性細胞中度浸潤，50%～75%的腎小管損傷)計為3分，輕度損傷(炎性細胞輕度浸潤，25%～50%的腎小管損傷)計為2分，輕微損傷(炎性細胞輕微浸潤，<25%的腎小管損傷)計為1分，無損傷(無炎性細胞浸潤，腎小管形態(tài)結構正常)計為0分。

2.5 TUNEL染色 大鼠腎臟組織進行固定、包埋、切片后二甲苯醇脫羧，加入蛋白酶K(20 μg/mL)，在37 ℃下放置15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，按照TUNEL組織凋亡檢測試劑盒方法操作，隨后在熒光顯微鏡下分析蘆薈素對大鼠腎臟細胞凋亡的影響。

2.6 RT-qPCR法檢測大鼠腎臟組織凋亡相關基因表達 取大鼠腎臟組織適量，采用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，通過Oligo軟件設計PCR引物，由金唯智(天津)生物公司合成。取cDNA模板2 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，SYBR實時定量PCR Mix試劑12.5 μL，雙蒸水補足25 μL，石蠟油封存后進行PCR擴增，條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)40次，反應結束后讀取CT值，分析溶解曲線特征，采用2-△△CT法進行定量分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot檢測大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 取大鼠腎臟組織適量，通過RIPA組織裂解液裂解，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分離上清，蛋白濃度采用二喹啉甲酸法檢測，通過SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，電泳結束后轉至聚偏氟乙烯膜，10%脫脂奶粉封閉后漂洗，加入一抗(1∶2 000)，在4 ℃冰箱中放置過夜，漂洗后再加入二抗(1∶5 000)，常溫孵育1 h，在膜上滴加超敏化學發(fā)光液，成像后拍照。

3 結果

3.1 蘆薈素減輕大鼠腎功能損傷 與假手術組比較，模型組大鼠血清BUN、Scr水平升高(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠血清BUN、Scr水平降低(P<0.01)，見表2。

表2 蘆薈素對大鼠血清BUN、Scr水平的影響

3.2 蘆薈素改善大鼠腎臟組織病理損傷 如圖1A所示，假手術組大鼠腎小管排列緊密，腎臟結構基本正常；模型組大鼠細胞變扁，輪廓結構不清，擴張呈囊狀，核固縮呈空泡性變樣、胞質疏松，腎間質炎性細胞浸潤明顯；蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎小管輕度擴張，結構基本正常，腎間質炎性細胞浸潤減輕，以中、高劑量組更明顯。如圖1B所示，與假手術組比較，模型組大鼠腎臟病理損傷評分升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠損傷評分降低(P<0.05)。

3.3 蘆薈素抑制大鼠炎癥反應 與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.01)，見表3。

表3 蘆薈素對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

3.4 蘆薈素抗大鼠腎臟細胞凋亡 與假手術組比較，模型組大鼠腎臟細胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟細胞凋亡率降低(P<0.01)，見圖2。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組大鼠腎臟組織病理損傷(×200)

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組大鼠腎臟細胞凋亡(×200)

3.5 蘆薈素調節(jié)大鼠腎臟凋亡相關基因表達 與假手術組比較，模型組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA表達及Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，而BaxmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA表達及Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)，而BaxmRNA表達降低(P<0.01)，見表4。

表4 蘆薈素對大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

3.6 蘆薈素對腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腎臟組織Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達降低(P<0.01)，而Bax蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達呈劑量依賴性升高(P<0.01)，而Bax蛋白表達降低(P<0.01)，見圖3、表5。

表5 蘆薈素對大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、PI3K、p-Akt蛋白表達的影響

4 討論

當腎功能受到損傷時，腎小球濾過功能會下降，引起Scr水平增加；損傷進一步加重時，BUN水平會增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素可以降低大鼠血清BUN、Scr水平；同時，腎臟病理損傷評分結果顯示，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠損傷評分降低。蘆薈素對大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護作用。

炎癥反應是腎缺血再灌注損傷重要的發(fā)病機制之一，TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子均參與了這一過程[10]。在炎癥反應的發(fā)生和維持過程中，TNF-α發(fā)揮關鍵作用，增加內皮素合成，使腎血流量和腎小球濾過率降低，導致腎功能衰竭、腎小球內皮損傷和腎細胞凋亡[11]。TNF-α也能刺激單核-巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6等促炎因子，進一步加重炎癥反應，IL-1β和IL-6的高表達是腎缺血再灌注損傷后炎癥反應的重要標志[12]。Birari等[13]發(fā)現(xiàn)，在阿霉素誘導的大鼠心臟毒性模型中，蘆薈素降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，推測蘆薈素對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用與抑制炎癥反應有關。

細胞凋亡是由多種基因參與調控的細胞自主性程序死亡進程，在腎缺血再灌注損傷的發(fā)生中占有重要地位[14]。Bcl-2基因家族主要由于Bcl-2和Bax基因構成，其中Bcl-2為抗凋亡基因，Bax為促凋亡基因，二者共同參與細胞凋亡調控[15]。Bcl-2/Bax比值對調控細胞凋亡進程具有更為重要的意義，Bcl-2/Bax比值越低，意味著凋亡現(xiàn)象越嚴重[16]。Xu等[17]發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝炎模型中，不同劑量的蘆薈素均可以促進Bcl-2表達上調和Bax、cleaved caspase-3表達下調，從而抑制肝細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素可以降低腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟細胞凋亡；蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA及蛋白表達、Bcl-2/Bax比值增加，而Bax mRNA及蛋白表達降低，提示抗腎臟組織細胞凋亡是蘆薈素具有保護腎缺血再灌注損傷作用的潛在原因。

多種信號通路參與腎缺血再灌注損傷過程，通路異常引起細胞凋亡，使腎功能降低，無法行使正常功能[18]。PI3K/Akt信號通路調控下游凋亡基因和蛋白的表達[19]。PI3K/Akt信號通路的激活，在保護腎缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用[20-21]。Dong等[22]發(fā)現(xiàn)，在小鼠外傷性腦損傷模型中，蘆薈素通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制凋亡的發(fā)生，促進模型小鼠腦功能的恢復。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達增加，激活PI3K/Akt信號通路，抗腎臟組織細胞凋亡。

總之，本研究證實蘆薈素預處理對大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與抑制炎癥反應及抗PI3K/Akt信號通路介導的細胞凋亡有關。