施 敏， 劉富林*， 涂琴蓉,2， 夏旭婷

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南師范大學附屬湘東醫(yī)院，湖南 株洲 412200)

胃腸動力障礙性疾病是指所有胃腸動力紊亂引起的以惡心、嘔吐、痞滿、排便異常等各種消化道癥狀為臨床表現(xiàn)的疾病，目前有專家認為其發(fā)生主要與胃腸道Cajal間質細胞(interstitial cell of Cajal,ICC)、胃腸激素和5-羥色胺、腸壁微血管病變和微循環(huán)障礙、代謝紊亂、精神心理因素等有關[1]，包括慢傳輸型便秘、腸易激綜合征、賁門失弛緩癥、糖尿病性胃腸病、慢性特發(fā)性假性腸梗阻等疾病。ICC細胞是胃腸道的起搏細胞, 不但具有產(chǎn)生自發(fā)性電信號的功能，并且可以傳導慢波信號，參與神經(jīng)遞質的調節(jié)[2]，其表達異?？芍挛改c平滑肌舒縮功能下降造成胃腸動力障礙[3]。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節(jié)，對于鈣離子的活化、釋放從而產(chǎn)生慢波電位至關重要[4]。

ICC細胞在維持正常胃腸動力方面發(fā)揮著重要作用，一些以其為靶向的藥物已應用于臨床或正在研究之中。中藥促進胃腸動力的效果強于莫沙必利等西藥，且效果持久，停藥后不易復發(fā)，遠期預后較佳[5]。枳術丸是以健脾運脾、理氣導滯通便立法，治療脾虛便秘的經(jīng)典名方，本課題組多年的臨床應用和實驗研究表明其能改善患者的胃腸排空功能和臨床癥狀，能夠促進脾虛便秘小鼠ICC細胞的增殖分化，結合PI3K/Akt信號通路在細胞增殖分化中的作用[6-7]，猜測枳術丸可能通過激活PI3K/Akt通路，上調PI3K、Akt表達，促進ICC細胞增殖，從而發(fā)揮調節(jié)胃腸動力的作用。

本實驗選用枳術丸湯劑，根據(jù)《脾胃論》[8]中枳術丸記載“白術二兩，枳實麩炒黃，去瓤，一 兩”的 2∶1 配比，以體外大鼠結腸ICC細胞為研究對象，觀察藥物血清對其增殖的影響以及對PI3K、Akt基因、蛋白表達的影響，探討相關調節(jié)胃腸動力的作用靶點及分子機制。

1 材料

1.1 動物、細胞株 20只SPF級雄性SD大鼠，體質量(220±5)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK(湘)2013-0005，實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準同意，編號HN-LL-2015-026。大鼠結腸ICC細胞購于賽百慷(上海)生物技術股份有限公司，編號RAT/MIC/RAB-iCell-d024，取第2、3代生長狀態(tài)良好細胞用于檢測。

1.2 藥材 枳術丸湯劑白術與枳實按2∶1的比例配制，由于文獻[9-10]報道方中白術的最佳有效劑量為60 g，故取白術60 g、枳實30 g，按5倍比例加蒸餾水浸泡30 min，文火煎煮40 min，煎煮液用紗布過濾，再加5倍量蒸餾水，文火煎煮40 min，紗布過濾，合并2次煎液，在75 ℃下蒸發(fā)濃縮成2 kg/L湯劑，置于玻璃瓶中，密封，標記，恢復至室溫后放入4 ℃冰箱冷藏。相關藥材購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院張志國主任藥師鑒定為正品。

1.3 試劑 原代細胞培養(yǎng)體系[賽百慷(上海)生物技術股份有限公司，批號PriMed-iCell-025]；胰蛋白酶(0.25%，美國Gibco公司，批號25200056)；細胞增殖毒性檢測(CCK-8)試劑(日本同仁化學研究所，批號KU746)；Tris、APS、SDS、TEMED、聚山梨酯-20(Tween-20)、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺(美國Sigma公司，批號分別為V900483、10002618、MB2479、T105497、30189328、0341、V900144、0172)；兔抗免疫球蛋白(Ig)G、鼠抗 IgG、大鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Proteintech公司，批號分別為SA00001-1、SA00001-2、10004413)；蛋白酶抑制劑(德國Merck公司，批號583794)；蛋白磷酸酶抑制劑(瑞士Roche公司，批號P1260)；SuperECL Plus超敏發(fā)光液(美國Thermo Pierce公司，批號K-12045-D50)；顯影液、定影液(上海市佳信科技有限公司，批號分別為BW-61、BW-62)；凋亡抑制蛋白(XIAP)、增殖細胞核抗原(PCNA)(英國Abcam公司，批號分別為ab21278、ab92552)；常規(guī)化學試劑(國藥控股上海生物醫(yī)藥有限公司)；LY294002(美國Selleck公司，批號S-1105)。

1.4 儀器 YT-CJ-2NB型超凈工作臺(蘇州智凈凈化設備有限公司)；DH-160I型直熱式CO2培養(yǎng)箱、PIKO REAL 96型熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光PCR板(美國Thermo公司)；DSZ2000X型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；BCD-245F型普通冰箱(合肥榮事達電子電器集團有限公司)；DW-HL388SL02型-80 ℃冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)；FA-N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；EnSpire型多功能酶標儀(美國Perkinelmer公司)；H1650R型臺式冷凍離心機(深圳黑馬公司)；DYCZ-24DN型電泳槽(美國Bio-Rad公司)；TS-92型水平搖床、DYY-6C型電泳儀、DYCZ-40D型轉膜儀(北京六一儀器廠)；QL-901型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；E-201-C型精密PH計[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；DY89-1型電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DY89-1型蓋玻片、AY89-2型載玻片(海門遠泰實驗器材廠)。

2 方法

2.1 原代ICC細胞培養(yǎng) 原代大鼠結腸ICC細胞使用原代間質細胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)。細胞株復蘇后，以1 mL胰蛋白酶消化貼壁細胞約1 min，倒置顯微鏡下觀察細胞回縮變圓形時，立即棄去消化液，加入2 mL完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，以1 mL的Tip頭輕輕吹打內(nèi)皮細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶脫落，置于15 mL離心管中，800 r/min離心5 min，再棄去上清液，加入全新的2 mL培養(yǎng)基重懸，以Tip頭輕柔打散細胞團塊，待細胞混和均勻后，以稀釋比例轉移至新的含完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每1～2 d換液1次。

2.2 含藥血清制備 將20只大鼠隨機分為枳術丸湯劑組、空白血清組，每組各10只，適應性喂養(yǎng)3 d，以60 kg成人每天服用枳術丸藥物劑量的3倍與220 g大鼠體表面積換算比值換算出大鼠1 d用量(根據(jù)公式D2=D1×R2/R1，R1=346.88，R2=7.502，D1=270 g)，枳術丸湯劑組灌胃枳術丸湯劑5.8 g/d，空白血清組灌胃等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h腹主動脈采血，室溫靜置2 h后離心取上清存于EP管，密封，在56 ℃恒溫水浴中滅活30 min，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。使用?7 ℃水浴解凍，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

2.3 分組與建模 選擇完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，待細胞傳代至3代時，選取80%融合、生長良好者，胰酶消化1 min后，細胞重懸計數(shù)，按照每孔1×104個細胞接種于96孔板中。待細胞密度達到80%后，加入不同濃度(15、25、35、45 μmol/L)的PI3K/Akt抑制劑LY294002進行干預，干預24 h后以CCK8法檢測細胞增殖抑制情況，分析確定大鼠結腸ICC細胞最佳的抑制劑濃度。將大鼠結腸ICC細胞分為正常組(正常細胞+培養(yǎng)液)、模型組(正常細胞+最佳抑制劑濃度的LY294002)、空白血清組(模型+最佳濃度的空白血清)、枳術丸湯劑組(模型+最佳濃度的枳術丸湯劑含藥血清)。

2.4 CCK8法檢測大鼠結腸ICC細胞增殖抑制率 大鼠結腸ICC細胞按照每孔1×104個細胞接種于96孔板中，經(jīng)過同步化處理24 h后，分別用15、25、35、45 μmol/L的含藥培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)24 h后吸棄上清，每孔加入100 μL反應液，37 ℃培養(yǎng)4 h，采用酶標儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值，并根據(jù)公式細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=1-[(OD藥物處理組-OD空白對照組)/(OD標準-OD空白對照組)]×100%，實驗重復3次。

2.5 含藥血清濃度及時間篩選 設立5%、10%、15%、20%含藥血清、空白血清分別作用于大鼠結腸ICC細胞，并設培養(yǎng)液作用于不含血清的正常組大鼠結腸ICC細胞。采用CCK8法根據(jù)OD值結果計算增殖率并進行統(tǒng)計學分析，篩選出最佳濃度。制成含藥血清最佳濃度后，設計細胞培養(yǎng)時間節(jié)點分別為12、24、48 h，計算增殖率并進行統(tǒng)計學分析，篩選出濃度的最佳時間，重復3次。

2.6 免疫熒光檢測ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 取出細胞爬片，PBS清洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入3% H2O2，37 ℃孵育30 min以滅活內(nèi)源性酶；PBS沖洗3次，每次3 min，10%正常血清或5% BSA封閉60 min，孵育一抗；PBS沖洗3次，每次5 min，孵育二抗；PBS沖洗3次，每次5 min，37 ℃下DAPI工作液染核10 min；PBS沖洗3次，每次5 min，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。大鼠結腸ICC細胞中PI3K、Akt均以紅色熒光為染色陽性，藍色為核染信號，染色結果通過熒光顯微鏡電腦采集400倍鏡下圖像，Image J軟件采集分析樣本中紅色部分的累積光密度(IOD)。

2.7 Western blot檢測ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 預冷PBS洗滌細胞1次后，棄去上清，加入200 μL RIPA裂解液吹打混勻，冰上裂解10 min，4 ℃離心后取上清，根據(jù)BCA試劑盒操作檢測蛋白濃度，蛋白樣品與5×Loading buffer混勻，沸水煮5 min后放入冰盒中速冷。配制SDS-PAGE膠，80、120 V電泳，300 mA轉膜；1×TBST中洗滌5 min，用麗春紅染膜，檢測蛋白轉膜的效率，1×TBST洗凈麗春紅，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h；加入稀釋好的一抗(Akt 1∶10 000，p-Akt 1∶5 000，PI3K 1∶1 000，p-PI3K 1∶750，β-actin 1∶5 000)4 ℃過夜孵育，1×TBST洗膜3次，每次15 min；用1×TBST稀釋HRP標記的二抗，兔抗(R)稀釋比例1∶6 000，鼠抗(M)稀釋比例1∶5 000，與膜共同孵育90 min，1×TBST洗3次，每次15 min；ECL化學發(fā)光液與膜孵育3 min，暗盒內(nèi)與X膠片曝光約15～120 min，顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，Quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

2.8 RT-qPCR檢測ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達 根據(jù)試劑盒說明書操作提取細胞總的RNA，按反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA，以其為模板進行PCR反應，反應體系為Template 2 μL,正反向引物各0.5 μL,PCR水12 μL,2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。反應條件為95 ℃預變性10 min; 95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶qbase plus軟件分析，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達。在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer5軟件設計引物，β-actin正向引物ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC，β-actin反向引物TACTC CTGCTTGCTGATCCAC；Akt正向引物ACGCCAAGGAG ATCATGCAG，Akt反向引物ATGCTGTCATCTTGGTCAGGT；PI3K正向引物CTTACCTAGCTCTTCGCCACC，PI3K反向引物CCCGGATGTATTCAATGTCCT。

3 結果

3.1 LY294002對大鼠結腸ICC細胞的增殖抑制作用 不同濃度LY294002作用于大鼠結腸ICC細胞，抑制率如圖1所示，隨著抑制劑濃度的升高，大鼠結腸ICC細胞增殖抑制率升高，說明LY294002對大鼠結腸ICC細胞增殖抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，濃度越高，抑制細胞增殖的效果越明顯。但在25 μmol/L濃度時，斜率趨于平緩，即抑制率趨于平緩，并且根據(jù)SPSS軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50值，置信限度范圍為24.8%～39.5%，選取25 μmol/L為實驗用最佳抑制劑濃度。

圖1 不同濃度LY294002干預大鼠結腸ICC細胞24 h后的增殖抑制率

3.2 含藥血清濃度、干預時間篩選 不同濃度的枳術丸湯劑含藥血清組及空白血清組分別作用于大鼠結腸ICC細胞，增殖率見表1?？瞻籽褰M與正常組比較其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，空白血清組不同濃度之間也無明顯差異(P>0.05)。與正常組比較，不同濃度枳術丸湯劑含藥血清組ICC細胞增殖率均增加(P<0.01)，其中5%枳術丸湯劑含藥血清細胞增殖率最高，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

表1 不同濃度血清干預大鼠結腸ICC細胞24 h后增殖率比較

取5%枳術丸湯劑含藥血清及10%空白血清分別作用于大鼠結腸ICC細胞，時間分別為12、24、48 h，增殖率見表2。與正常組比較，10%空白血清組作用于3個不同時間后ICC細胞增殖率無明顯變化(P>0.05)，5%枳術丸湯劑含藥血清組ICC細胞增殖率均升高，且以作用24 h最高(P<0.01)。由此可知，根據(jù)課題組枳實、白術單味藥部分實驗結果[11]，選取10%作為藥物濃度，選取5%枳術丸湯劑作為最佳作用濃度，最佳反應時間點為24 h。

表2 不同作用時間下血清干預大鼠結腸ICC細胞增殖率比較

3.3 免疫熒光檢測大鼠結腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 如表3、圖2～3所示，與正常組比較，模型組ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，枳術丸湯劑組ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達均升高(P<0.01)；與空白血清組比較，枳術丸湯劑組ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達升高(P<0.05)。圖2～3中紅色熒光(PI3K、Akt蛋白)為染色陽性，藍色為核染信號。

圖2 各組大鼠結腸ICC細胞中PI3K蛋白表達(免疫熒光，×400)

表3 各組大鼠結腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達比較

3.4 Western blot檢測大鼠結腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 如表4、圖4所示，與正常組比較，模型組ICC細胞中PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，枳術丸湯劑組ICC細胞中PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均升高(P<0.01)；與空白血清組比較，枳術丸湯劑組ICC細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-PI3K蛋白表達均升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠結腸ICC細胞中Akt蛋白表達(免疫熒光，×400)

圖4 各組大鼠結腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達

表4 各組大鼠結腸ICC細胞PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較

3.5 RT-qPCR檢測大鼠結腸ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達 如表5所示，與正常組比較，模型組ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，枳術丸湯組ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達均升高(P<0.01)；與空白血清組比較，枳術丸湯劑組ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達均升高(P<0.05，P<0.01)。

表5 各組大鼠結腸ICC細胞中PI3K、Akt mRNA表達比較

4 討論

胃腸動力障礙性疾病屬于中醫(yī)“痞證”“納呆”“腹?jié)M”“便秘”等范疇[12]，脾胃虛弱、氣機失調為其病機，以調理脾胃氣機為基本治則[13]。枳術丸始于《金匱要略》中的枳術湯，后變化為丸劑，方中白術[14]功效主要在于益氣補脾燥濕，并通過補氣健脾來調整胃的消化腐熟功能[15]；枳實功效破氣消積、化痰除痞，二藥合用消補共施，可有調養(yǎng)之效。

胃腸道ICC細胞是以網(wǎng)狀結構存在于胃腸道的一類特殊間質細胞，是胃腸道活動的起搏者和調節(jié)者，壁內(nèi)神經(jīng)信息向平滑肌傳送的中轉站，控制胃腸道平滑肌的收縮和蠕動，其自噬過度可使ICC細胞與平滑肌細胞之間，神經(jīng)與平滑肌之間的慢波電位產(chǎn)生、神經(jīng)興奮傳遞、神經(jīng)反射與平滑肌收縮節(jié)律失去調控，胃腸平滑肌舒縮功能下降等，造成胃腸動力障礙[16]。

課題組前期實驗證實枳術丸能改善脾虛患者的胃腸排空功能和臨床癥狀，能提高STC小鼠結腸黏膜ICC的數(shù)量，上調C-kit、SCF的表達，促進慢傳輸型便秘小鼠結腸功能恢復[6-7，11，17]。本研究結果顯示，25 μmol/L PI3K/Akt抑制劑LY294002、5%枳術丸湯劑含藥血清及10%空白血清干預大鼠結腸ICC細胞24 h為最佳干預措施。正常組大鼠結腸ICC細胞中PI3K、AktmRNA高表達；與正常組比較，模型組p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白和PI3K、AktmRNA表達均降低，說明大鼠結腸Cajal間質細胞生長受到抑制，且與PI3K、Akt表達降低有關。PI3K/Akt是C-kit/SCF途徑下游信號轉導通路之一[18]，SCF/c-kit系統(tǒng)通過PI3K信號通路PI3K→Akt→mTOR→P70S6K→Cyclin D3→Rbp42/p94完成細胞DNA合成信號的傳遞，導致細胞周期G1期向S期轉變而介導細胞增殖。Ward等[19]報道用Wortmannin及LY294002阻斷C-kit/SCF信號途徑下游信號分子PI3K，可導致ICC細胞發(fā)育及表型異常。與模型組比較，枳術丸湯劑組p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白和PI3K、AktmRNA表達均升高；與空白血清組比較，枳術丸湯劑組p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白和PI3K、AktmRNA表達均升高，表明枳術丸能在一定程度上促進ICC細胞增殖，其機制可能與作用于PI3K、Akt信號通路，上調PI3K和Akt的表達有關。

然而，本研究尚存在不足，其一是采取枳術丸湯劑，然文獻記載枳術丸為“荷葉裹燒飯為丸”的丸劑，改用湯劑后功效與丸劑功效的一致性難以定量與鑒別，其中的差別有待進一步研究；其二是未檢測PI3K、Akt對應的表型。課題組將繼續(xù)進一步研究，深入探索枳術丸湯劑含藥血清在改善胃腸動力方向的作用機制。