牟 燕， 劉世芳， 尹翠云， 唐德英， 俞 靜， 張麗霞

(中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所，云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室，云南 景洪 666100)

植物內(nèi)生真菌是一類廣泛存在于宿主植物體內(nèi)的具有豐富多樣生物活性的微生物類群。在長期進化過程形成了豐富的代謝系統(tǒng)，可產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的次生代謝產(chǎn)物，還能獨立產(chǎn)生大量的、結構新穎且具有多種生物活性的物質(zhì)[1-2]。Satish等[3]從青翠枝植物中分離得到一株內(nèi)生真菌，在其液體培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了喜樹堿。石杉堿甲具有抑制乙酰膽堿酯酶活性，但其獲取途徑單一，資源稀少，合成工藝繁瑣復雜、成本高，而通過對其內(nèi)生真菌的研究能獲得了多個能產(chǎn)該成分的菌株[4-6]，具有重要應用價值和可持續(xù)發(fā)展意義。

南板藍根為爵床科植物馬藍Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.的干燥根莖和根，含有吲哚生物堿、喹唑啉酮生物堿等多種成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒和抗炎等藥理活性，并對肝臟有保護作用[7-8]，在預防和治療嚴重急性呼吸道綜合癥中潛在功效良好[9]，但其生長周期長，產(chǎn)量低，野生資源分散且少，目前相關研究主要集中于資源、栽培、化學成分、生物活性等方面，鮮有涉及內(nèi)生真菌?；诖耍狙芯坎捎弥参锝M織表面滅菌法，對南板藍根根、莖、葉中內(nèi)生真菌進行分離純化，篩選出具有生物活性的菌株，以期為該植物進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 藥材 南板藍根為一年生栽培品，健康植株采自云南省紅河州金平縣，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所李學蘭研究員鑒定為南板藍根Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.，標本保存于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA 取洗凈去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊狀，加入1 000 mL超純水煮沸30 min，上清液用紗布過濾，加瓊脂15 g、葡萄糖20 g，攪拌溶解完全后補充超純水至體積為1 000 mL，整個過程中pH值保持不變，在121 ℃下滅菌30 min。同時，在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素、卡那霉素各150 mg/L。

1.2.2 LB 取酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0～7.2，在121 ℃下滅菌30 min。

1.3 菌株 金黃色葡萄球菌S.aureus、大腸桿菌E.coli均為本實驗室保存。

1.4 試劑 甲醇、無水乙醇、二甲亞砜、濃鹽酸、乙酸乙酯、次氯酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫均為分析純，購于昆明仁科商貿(mào)有限公司；蔗糖、瓊脂粉、卡那霉素、氨芐青霉素、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基、抗壞血酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒均購于上海泰坦科技股份有限公司；水為超純水。

1.5 儀器 AB135-S電子分析天平(十萬分之一)、PL203電子分析天平(千分之一)(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；SKHG-1MDZAG干燥箱(廣州泉能智能科技股份有限公司)；HZP-92恒溫培養(yǎng)搖床、HDPN-II-150電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；MLS-37811L-PC高壓蒸汽滅菌鍋(松下健康醫(yī)療器械上海有限公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi公司)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌分離純化 將藥材根、莖和葉沖洗干凈，在超凈工作臺時將其置于50%次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，取出用無菌水沖洗4～5次，再置于75%乙醇中浸泡2 min，取出用無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干水分，去掉消毒過程中暴露的末端，根和莖切成1 cm的小段，葉切成1 cm×1 cm的小塊，無菌鑷子接種于分裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中接種5段，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)3～15 d，每天觀察真菌生長情況，待組織邊緣長出菌落時，將菌絲轉(zhuǎn)接于新培養(yǎng)皿中純化4～5次，直至得到形態(tài)顏色完全一致的單菌落。將最后一次清洗樣品的無菌水作為無菌參照，以保證分離得到的菌株為內(nèi)生真菌，并且無染菌。純化后的菌株編號后接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2 內(nèi)生真菌鑒定

2.2.1 形態(tài) 取純化后的菌株，采用點植法接種于PDA培養(yǎng)皿中心，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，待菌絲生長至整個表面后置于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察菌落、菌絲體、孢子形態(tài)。參照真菌鑒定手冊進行初步鑒定[10]。

2.2.2 分子生物學 待純化的菌株長滿整個培養(yǎng)皿后，在無菌狀態(tài)下挑取菌絲，置于研缽中用液氮充分研磨菌絲體至粉末狀，采用DNA提取試劑盒提取菌株DNA，ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[11]，委托昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，測序片段用BLAST軟件進行同源性比對，通過MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining methods，NJ)、基于Kimura 2-parameter距離構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，并以自展法(bootstrap)進行檢測，自展次數(shù)設為1 000次。

2.3 抑菌活性研究

2.3.1 菌液制備 挑取適量活化后內(nèi)生真菌接種于PDB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、135 r/min下培養(yǎng)7 d。在發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯，超聲萃取3次，合并后減壓蒸干溶劑得浸膏，真空干燥，制成10.24 mg/mL溶液[二甲基亞砜(DMSO)體積分數(shù)不超過5%]，將卡那霉素同法配制成相同質(zhì)量濃度陽性對照溶液。選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為病原指示菌株，活化后接種于LB培養(yǎng)基中，置于搖床上，在37 ℃、120 r/min下培養(yǎng)16～18 h，吸取20 μL培養(yǎng)液，無菌水稀釋至200 mL，菌落個數(shù)為1×105～1×106cfu/mL，作為供試菌液。

2.3.2 微量二倍稀釋法 在96孔培養(yǎng)板的第1孔中加入90 μL 10.24 mg/mL待測溶液，第2孔中加入100 μL 10.24 mg/mL待測溶液、80 μL空白培養(yǎng)基，第3～8孔中均加入90 μL空白培養(yǎng)基，將第2孔中的溶液充分混勻后取90 μL，加到第3孔中，以此類推，最終第1～8孔均加入稀釋供試菌液10 μL，第2～7孔中待測樣品質(zhì)量濃度分別為5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 mg/mL，第1孔中待測樣品溶液質(zhì)量濃度為9.22 mg/mL，僅含稀釋后的供試菌液和空白培養(yǎng)基的第8孔作為陰性對照，卡那霉素作為陽性對照(實驗結束時，空白培養(yǎng)基和孔均應保持澄清透明，證明滅菌完全，并且操作過程中未出現(xiàn)染菌現(xiàn)象)。將接種好病原指示菌的96孔平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h后取出，觀察各孔菌落生長情況，若渾濁，說明有病原菌生長；若澄清透明，則說明該孔相應的待測物對病原菌有抑制作用，以沒有病原菌生長的待測物最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)值[12]。每個樣品均作3組平行。

采用CLSI M27-A3中規(guī)定的肉眼觀察法判定待測樣品的MIC值，按照規(guī)定在光線充足的中午由2個人同時觀察試驗結果，并作出判定。將含藥試驗孔與陽性對照孔、陰性對照孔進行對比，分為5個等級，0級為試驗孔肉眼觀察清晰，無渾濁現(xiàn)象(100%受抑制)；1級為試驗孔肉眼觀察略微渾濁(80%受抑制)；2級為試驗孔肉眼觀察渾濁度明顯下降(50%受抑制)；3級為試驗孔肉眼觀察渾濁度輕微下降；4級為試驗孔肉眼觀察渾濁度未下降。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除率測定 將浸膏用無水乙醇制成0.5 mg/mL溶液，取1 mL，與3 mL 0.1 mmol/mL DPPH溶液加到10 mL離心管中，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心5 min，在517 nm波長處測定吸光度A1；將1 mL樣品溶液與3 mL無水乙醇加到10 mL離心管中，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心5 min后測定吸光度A2；將3 mL DPPH溶液和1 mL超純水加到10 mL離心管中；室溫靜置30 min，5 000 r/min離心5 min后測定吸光度A0，以維生素C為陽性對照，重復3次[13]，計算清除率，公式為清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。再將清除率對受試物濃度對數(shù)進行非線性回歸擬合抑制曲線，計算IC50值。

2.4.2 羥基自由基清除率測定 將浸膏用無水乙醇制成0.5 mg/mL溶液，取1 mL至10 mL離心管中，依次加入1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，搖勻后靜置6 min，再加入1 mL過氧化氫溶液，混勻后2 500 r/min離心20 min，在510 nm波長處測定吸光度A1；用超純水替代過氧化氫溶液，測定吸光度A2；用無水乙醇代替樣品溶液，測定吸光度A0，以維生素C為陽性對照，重復3次[14]，計算清除率，公式為清除率=[1-(A1-A2)/A0]× 100%。再將清除率對受試物濃度對數(shù)進行非線性回歸擬合抑制曲線，計算IC50值。

2.4.3 總還原力測定 采用鐵氰化鉀還原法[15]。將浸膏用無水乙醇制成0.5 mg/mL溶液，取2.5 mL至15 mL離心管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴保溫20 min后取出，迅速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，2 000 r/min離心10 min，取上層清液2.5 mL，依次加入2.5 mL超純水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，搖勻后靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度。再將維生素C用無水乙醇制成0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1 mg/mL溶液作為對照，同法測定其吸光度。

3 結果

3.1 內(nèi)生真菌鑒定 共分離純化出35株內(nèi)生真菌，根據(jù)菌株的外觀形態(tài)及微特征初步去除重復，剩余的菌株通過分子生物學進行序列測定并在BLAST中比對，最終獲得23株，其中根部11株、葉部9株、莖部3株，歸屬為7目9科11屬。菌株編號Nb 1～Nb 23，見表1。內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化分析見圖1。

表1 南板藍根內(nèi)生真菌分離鑒定Tab.1 Separation and identification of endophytic fungi from B. cusia

圖1 基于ITS序列的南板藍根內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化分析Fig.1 Phyogenetic analysis of rDNA-ITS sequences of endophytic fungi from B. cusia

植物內(nèi)生真菌的分布具有組織偏好性，其種群結構差異明顯[16]。在23株內(nèi)生真菌中，Diaporthe和Fusarium為南板藍根第一優(yōu)勢屬內(nèi)生真菌，其占比均為21.74%，其中在根部分離得到11株，占總菌株數(shù)的47.83%，包括Cladosporium、Fusarium、Xylaria、Setophoma、Purpureocillium、Penicillium，其優(yōu)勢屬為Fusarium，占根中總數(shù)的45.45%；在莖部分離得到3株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的13.04%，包括Diaporthe、Phomopsis，其優(yōu)勢屬為Diaporthe，占莖中總數(shù)的66.67%；在葉部分離得到9株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的39.13%，包括Cladosporium、Nemania、Diaporthe、Penicillium、Aspergillus、Phyllosticta，其優(yōu)勢屬為Diaporthe，占葉中總數(shù)的33.33%,見圖2。

圖2 南板藍根內(nèi)生真菌分布Fig.2 Distribution of endophytic fungi from B. cusia

3.2 抑菌活性

3.2.1 金黃色葡萄球菌 表2顯示，有12株菌的發(fā)酵物對金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制活性，其中Nb 6、Nb 12、Nb 19較強。

表2 南板藍根內(nèi)生真菌發(fā)酵物對金黃色葡萄球菌的抑制活性Tab.2 Inhibitory activities of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia on S.aureus

3.2.2 大腸桿菌 表3顯示，有11株菌的發(fā)酵物對大腸桿菌有不同程度的抑制活性，其中Nb 2、Nb 7、Nb 19較強。

表3 南板藍根內(nèi)生真菌發(fā)酵物對大腸桿菌的抑制活性Tab.3 Inhibitory activities of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia on E. coli

3.3 抗氧化活性

3.3.1 DPPH自由基清除率 圖3顯示，除菌株Nb 16外，其他22株內(nèi)生真菌發(fā)酵物均對DPPH自由基表現(xiàn)出清除活性，其中9株清除率大于50%，以Nb 19、Nb 22、Nb 2較高(分別為89.03%、87.61%、82.25%)，IC50值分別為54.86、59.26、64.02 μg/mL，同時三者分屬于Penicillium、Aspergillus、Cladosporium屬，并且均來源于葉部。

圖3 南板藍根內(nèi)生真菌發(fā)酵物對DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rates of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia

3.3.2 羥基自由基清除率 圖4顯示，23株內(nèi)生真菌發(fā)酵物均對羥基自由基表現(xiàn)出清除活性，其中Nb 19、Nb 10、Nb 14較強，清除率分別為53.58%、50.77%、50.24%，IC50值分別為104.80、127.70、109.30 μg/mL，同時三者分屬于Penicillium、Nemania、Diaporthe屬，并且均來源于葉部。

圖4 南板藍根內(nèi)生真菌發(fā)酵物對羥基自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rates of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia

3.3.3 總還原力 圖5顯示，23株內(nèi)生真菌發(fā)酵物均具有不同程度的總還原能力，其中Nb 3、Nb 2、Nb 11、Nb 22較強，維生素C當量分別為14.73、13.39、11.26、10.39 mg/L，分屬于Fusarium、Cladosporium、Setophoma、Aspergillus屬，并且Nb 3、Nb 11來源于根部，Nb 2、Nb 22來源于葉部。

圖5 南板藍根內(nèi)生真菌發(fā)酵物總還原力Fig.5 Total reducing capacities of fermentation extracts of endophytic fungi from B. cusia

4 討論

本研究從南板藍根中分離出23株內(nèi)生真菌，其中根部11株，葉部9株，莖部3株，對其進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，采用二倍稀釋法測定抑菌活性，發(fā)現(xiàn)Nb 19、Nb 14、Nb 12、Nb 10、Nb 9、Nb 8、Nb 2對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有不同程度的抑制活性，占總菌株的34.78%，分屬于Penicillium、Diaporthe、Setophoma、Xylaria屬，表明其數(shù)量和種類均存在差異。Meng等[17]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌PenicilliumbrocaeMA-231中次生代謝產(chǎn)物brocapyrrozins A對金黃色葡萄球菌有抑菌活性；Sousa等[18]發(fā)現(xiàn)，苦苣苔屬植物中內(nèi)生真菌Diaporthesp. F2934次生代謝產(chǎn)物膦類化合物A和C對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌活性；徐國波等[19]從花蓼內(nèi)生真菌Diaporthesp.代謝產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)了具有抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性成分；Ding等[20]發(fā)現(xiàn)，分離自喜樹的Diaporthesp.和Xylariasp.均具有抗菌活性；Zhou等[21]在對從毛竹中分離的一株Setophomasp.，發(fā)現(xiàn)其對多種臨床致病菌均有抑制作用。

抗氧化劑可抑制自由基的反應過程或干擾自由基連鎖反應的引發(fā)與擴散過程[22]，本實驗采用DPPH法測定南板藍根內(nèi)生真菌清除DPPH自由基的活性，水楊酸法測定清除羥基自由基活性，鐵氰化鉀法測定總還原能力，從而考察其抗氧化活性。部分內(nèi)生真菌能參與植物活性成分的合成，可能會產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的化合物及其衍生物[23]。Gu等[24]研究表明，從南板藍根中分得的化合物對金黃色葡萄球菌具有微弱的抑制活性；Li等[25-26]發(fā)現(xiàn)，南板藍根水提物、80%甲醇提取物均表現(xiàn)出微弱的抗氧化活性。經(jīng)過綜合篩選，確定菌株Nb 19、Nb 2中可能存在待研究開發(fā)的潛在活性成分，今后可進一步考察兩者是否會產(chǎn)生與宿主植物南板藍根相同或相似的次生代謝產(chǎn)物。