張聰聰， 劉瀚澤， 王永麗， 張定棋， 陳佳美， 劉 偉*， 劉 平， 王長虹*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203)

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim. ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效[1]，其主要化學(xué)成分包括蒽苷、二苯乙烯、有機酸、鞣質(zhì)[2-3]。桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.) Batsch或山桃Prunusdavidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟種子，具有活血祛瘀、潤腸通便、止咳平喘的功效[1]，化學(xué)成分主要有苦杏仁苷、脂肪酸、蛋白質(zhì)、甾醇及其糖苷、黃酮、酚酸等[4]。大黃-桃仁藥對是臨床常用的破瘀藥對，兩者配比主要為5∶1～4∶1，共136首，占比95.8%[5]，功效活血祛瘀、消癰解毒、泄熱通便、溫陽散寒、健脾養(yǎng)胃、舒筋活血，其中主活血祛瘀的藥對有58首，占比40.8%[6]。現(xiàn)代研究表明，大黃-桃仁藥對具有抗炎、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗肝纖維化、抗術(shù)后粘連性腸梗阻等藥理作用[7-8]。

藥對是中藥配伍應(yīng)用的重要模式，由于其組成相對簡單，療效及物質(zhì)基礎(chǔ)更容易被解析，因而相關(guān)研究已成為闡釋中醫(yī)藥治療復(fù)雜性疾病科學(xué)理論及指導(dǎo)其新藥研發(fā)的重要突破口之一[9]。中藥配伍使用后產(chǎn)生助溶、沉淀、化學(xué)反應(yīng)等現(xiàn)象，有效成分溶出率發(fā)生變化，這并非單味藥“數(shù)”“量”上的簡單相加，對臨床療效也可產(chǎn)生影響[10]。文獻[11-14]報道，桃仁中含有苦杏仁苷酶，可水解苦杏仁苷等糖苷類成分，對大黃中的蒽醌苷類成分也可能具有水解作用。本實驗建立UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS法同時測定大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚-1-O-葡萄糖苷、番瀉苷A、番瀉苷B、兒茶素、沒食子酸、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、1,8-二羥基蒽醌、苦杏仁苷、野黑櫻苷含量，考察大黃-桃仁藥對不同比例配伍水煎液中其變化，以期探索不同配伍方式及配伍比例對主要成分溶出的影響，也為該藥對配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Q Exactive 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)，美國 Milli-pore公司；YH系列電熱器(500 mL，江蘇近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠)；DK-8D型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；BP211D電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)。

1.2 藥物與試劑 大黃(批號20200504)、桃仁(批號20190824)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所王長虹研究員鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的根莖、薔薇科植物山桃Prunusdavidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟種子。大黃素(批號J0610AS)、蘆薈大黃素(批號N1126AS)、番瀉苷A(批號00912AS)、番瀉苷B(批號J0603AS)、兒茶素(批號M0706AS)、沒食子酸(批號D0409AS)對照品均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；大黃酸(批號PRF7080541)、大黃素-8-O-葡萄糖苷(批號PRF8082225)、大黃素-1-O-葡萄糖苷(批號PRF8060621)、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷(批號PRF8081202)、大黃酸-8-O-葡萄糖苷(批號PRF8102402)、大黃酚-1-O-葡萄糖苷(貨號PRF9040201)、大黃酚-8-O-葡萄糖苷(批號PRF9072024)對照品均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；1,8-二羥基蒽醌(批號HO1017YA14)、野黑櫻苷(批號X06D9L77005)、苦杏仁苷(批號M0905AS)對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于99%。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(美國Thermo Fisher Scientific公司)；水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Dionex Ultimate 3000高壓液相系統(tǒng)，Acquity UPLC? BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫(0～0.5 min，10%乙腈；0.5～5 min，10%～33%乙腈；5～11.5 min，33%～90%乙腈；11.5～13.5 min，90%乙腈；13.51～15 min，10%乙腈)；體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀；電噴霧離子源(H-ESI)，輔助氣流量13 arb；輔助加熱器溫度300 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；自動增益控制(AGC)106，s-lens射頻水平50；正離子模式鞘氣(N2)流量35 arb，噴霧電壓3.5 kV；負離子模式鞘氣(N2)流量35 arb，噴霧電壓2.5 kV；負離子Full MS-SIM模式，掃描范圍m/z100～1 500。其他主要參數(shù)見表1，總離子流圖見圖1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 對照品溶液制備 取16種對照品適量，精密稱定，甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的貯備液，精密量取適量，甲醇稀釋，制成沒食子酸、兒茶素、苦杏仁苷、野黑櫻苷質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL，其他12種成分質(zhì)量濃度為50.0 μg/mL的溶液，即得。

2.4 供試品溶液制備

2.4.1 單煎液和不同配比大黃桃仁煎煮液 將大黃、桃仁粉碎成粗粉，分為大黃單煎組(大黃1 g，桃仁0 g)、大黃-桃仁5∶1組(大黃0.833 g，桃仁0.167 g)、大黃-桃仁4∶1組(大黃0.8 g，桃仁0.2 g)、大黃-桃仁2∶1組(大黃0.67 g，桃仁0.33 g)、大黃-桃仁1∶1組(大黃0.5 g，桃仁0.5 g)、大黃-桃仁1∶2組(大黃0.33 g，桃仁0.67 g)、大黃-桃仁1∶4組(大黃0.2 g，桃仁0.8 g)、大黃-桃仁1∶5組(大黃0.167 g，桃仁0.833 g)、桃仁單煎組(大黃0 g，桃仁1 g)，采用冷凝回流法，加入10倍量水煎煮30 min，濾過，藥渣再加入10倍量水煎煮30 min后過濾，合并2次濾液，純水定容至50 mL量瓶中，平行3份，20%甲醇稀釋10倍，0.21 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4.2 大黃桃仁溫浸液 取大黃、桃仁粗粉，分為大黃單藥組、大黃-桃仁(1∶1)藥對組、桃仁單藥組，置于100 mL錐形瓶中，分別加入1 g大黃、1 g大黃+1 g桃仁、1 g桃仁，加入50 mL水，置于50 ℃水浴鍋中溫育，平行3份，分別在5 min、20 min、1 h、3 h、6 h、10 h、24 h搖勻后取100 μL，立即加到400 μL乙腈中，混勻，20%甲醇稀釋20倍，0.21 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3”項下貯備液適量，20%甲醇稀釋并定容，依次配制成8個質(zhì)量濃度，其中沒食子酸、兒茶素、苦杏仁苷、野黑櫻苷分別為1.31、3.28、8.19、20.48、51.20、128.00、320.00、800.00 ng/mL，大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚-1-O-葡萄糖苷、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、1,8-二羥基蒽醌分別為3.28、8.19、20.48、51.20、128.00、320.00、800.00、2 000.00 ng/mL，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，以信噪比(S/N)>10計算最低定量限(LLOQ)，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗 制備沒食子酸、兒茶素、苦杏仁苷、野黑櫻苷、大黃素質(zhì)量濃度為1.31 ng/mL，大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚-1-O-葡萄糖苷、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、1,8-二羥基蒽醌質(zhì)量濃度為3.28 ng/mL的對照品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次，測得各成分峰面積RSD為2.07%～8.75%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 按“2.4.1”項下方法平行制備6份大黃-桃仁(1∶1)煎煮液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得各成分含量RSD為1.10%～6.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取3份“2.4.1”項下大黃-桃仁(1∶1)煎煮液，室溫(25 ℃)下于0、4、8、12、24 h在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得各成分含量RSD為1.58%～2.88%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 按“2.4.1”項下方法平行制備9份大黃-桃仁(1∶1)煎煮液，每3份為1組，加入對照品溶液適量，使加入后各成分含量分別為大黃-桃仁(1∶1)煎煮液中相應(yīng)成分含量的50%、100%、150%。結(jié)果，各成分加樣回收率為95.38%～104.90%，RSD為1.06%～7.58%。

2.10 含量測定

2.10.1 單煎液和不同配比大黃桃仁煎煮液中 按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3～4,可知單煎液和大黃桃仁不同配比情況下的水煎液中其溶出率具有明顯差別。隨著大黃配伍比例的減少，大黃中兒茶素、番瀉苷B、番瀉苷A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、1，8-二羥基蒽醌溶出量整體具有增加的趨勢；沒食子酸溶出量整體上具有減少的趨勢；蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃酸-8-葡萄糖苷、大黃素-8-葡萄糖苷溶出量具有先增加后降低的趨勢，大黃-桃仁1∶1時溶出率最高；大黃素-1-葡萄糖苷、大黃酚-1-葡萄糖苷、大黃酚-8-葡萄糖苷溶出量也具有先增加后降低的趨勢，大黃-桃仁1∶4時溶出率最高。隨著桃仁配伍比例的增加，桃仁中苦杏仁苷、野黑櫻苷溶出率具有先增加后降低的趨勢，其中苦杏仁苷在大黃-桃仁4∶1時溶出率最高，野黑櫻苷在2∶1時溶出率最高。

表3 單煎液和大黃桃仁藥對不同配比下煎煮16種待測成分溶出測定結(jié)果Tab.3 Dissolution results of sixteen target analytes in decoctions of single herband drug pairs with different proportions of R. palmatum and P.

表4顯示，大黃-桃仁4∶1時16種成分總?cè)艹隽孔罡撸?∶4時最低；來源于桃仁的成分溶出量隨著桃仁占比增加具有先增加后降低的趨勢，在大黃-桃仁4∶1時最高；來源于大黃的成分溶出量隨著大黃占比減少具有增加趨勢，在大黃-桃仁1∶2～1∶5時較高，1∶2時最高；大黃鞣酸、蒽醌類成分溶出量隨著大黃占比減少整體具有增加趨勢，其中鞣酸類成分在大黃-桃仁1∶2時最高，蒽醌類成分在1∶5時最高；大黃蒽醌苷類成分溶出量隨著大黃占比減少整體具有先增加后降低趨勢，在大黃-桃仁1∶4時最高；大黃蒽醌苷元類成分溶出量隨著大黃占比減少整體具有增加趨勢，在大黃-桃仁1∶5時最高。

表4 單煎液和大黃桃仁藥對不同配比下煎煮各類成分含量Tab.4 Contents of various constituents in single decoction and different proportions of R. palmatum and P. davidiana

2.10.2 不同時間大黃桃仁溫浸液中 按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得大黃單藥組、大黃-桃仁(1∶1)藥對組、桃仁單藥組在50 ℃溫育不同時間后16種成分的含量，結(jié)果見圖2。由此可知，在溫浸條件下桃仁單藥組僅在5、20 min溫浸液中檢測到少量苦杏仁苷和野黑櫻苷，大黃-桃仁(1∶1)藥對組溫浸液中5 min時可以檢測到較高含量的兩者，隨著溫浸時間延長含量迅速下降，3 h以后低于定量限；對大黃單藥組與大黃-桃仁(1∶1)藥對組成分含量進行比較，發(fā)現(xiàn)不同時間點2組溫浸液中沒食子酸、番瀉苷B、番瀉苷A、大黃素?zé)o明顯差異；但其他10種成分差異明顯，其中蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-1-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷在大黃單藥組中顯著高于藥對組中，兒茶素、蘆薈大黃素、1,8-二羥基蒽醌、大黃酸恰好相反。

注：△為大黃單藥組組，□為大黃-桃仁(1∶1)藥對組，○為桃仁單藥組。圖2 不同溫浸時間對大黃桃仁藥對中16種成分溶出的影響Fig.2 Effects of different immersion time on the dissolution of sixteen target analytes in immersion of R. palmatum and P. davidiana drug pair

3 討論

本研究建立了同時測定大黃-桃仁藥對中16種成分含量的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS法，發(fā)現(xiàn)它們在單煎液和不同配比大黃-桃仁藥對水煎液中的溶出具有明顯差別，可能與煎煮加熱升溫過程中桃仁中的β-葡萄糖苷酶水解糖苷類成分有關(guān)。參照文獻[14]，驗證桃仁中β-葡萄糖苷酶可水解大黃和桃仁中的糖苷類成分，它是在桃仁、苦杏仁[14]、桔梗[15]、天麻[16]等中藥中普遍存在的一種水解酶，提示使用相關(guān)藥味時需要關(guān)注酶對糖苷類成分的影響。近年來，腸道菌群與中藥成分之間的相互作用備受關(guān)注，前者有許多細菌含有豐富的糖苷水解酶基因，能產(chǎn)生糖苷水解酶[17]，還含有許多其他類型的酶(氧化酶、還原酶、酯酶等)，可進行廣泛的藥物代謝。大黃、桃仁均含有大量糖苷類成分，如大黃中的結(jié)合性蒽醌苷類成分能在腸道菌作用下轉(zhuǎn)化成游離蒽醌，可能導(dǎo)致其活性或毒性發(fā)生改變，而番瀉苷A等成分可調(diào)節(jié)腸道菌的組成與腸道代謝物，提示大黃與腸道菌之間存在特殊的相互作用[18-19]；桃仁中的苦杏仁苷能在腸道菌作用下水解為野黑櫻苷、扁桃腈，再分解成毒性較強的氫氰酸。

本實驗建立的方法與目前報道的HPLC法[20-23]相比，不需要待測物完全基線分離及UHPLC/UFLC[24]，因而檢測時間大大縮短，但液質(zhì)儀器較為昂貴，成本也有所增加；基于四極桿-靜電場軌道阱技術(shù)的高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)進行定量研究，是利用其高分辨的功能特點，采用一級質(zhì)譜精確定量，并在保證極高的穩(wěn)定性和準確度同時簡化了操作流程，節(jié)省了分析時間，可為大黃-桃仁藥對配伍物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步研究提供科學(xué)、穩(wěn)定、可靠的技術(shù)支持。