劉志超， 高晟瑋， 陳金紅， 馬 莉， 王保和， 谷旭放*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是危害人類健康的重大急性疾病，近年來隨著經(jīng)濟的迅速發(fā)展、生活方式的轉(zhuǎn)變、人口老齡化的加劇，在我國其發(fā)病率和死亡率呈逐年增長趨勢，已成為疾病死因首位[1-2]。亞洲其他各國研究也表明，急性心肌梗死早期風(fēng)險與使用藥物介入治療或直接介入治療有關(guān)[3-4]。盡管急性心肌梗死治療指南指出，本病治療以抗栓為主，但存在一定風(fēng)險，包括出血事件、消化系統(tǒng)不良反應(yīng)，故控制發(fā)病率、提高救治水平正成為心血管領(lǐng)域的重要研究課題。

急性心肌梗死根據(jù)其癥狀、證候表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛”范疇，中醫(yī)藥對該病的治療積累了豐富的經(jīng)驗。但現(xiàn)有證據(jù)顯示，在我國中醫(yī)院治療急性心肌梗死過程中，僅有32.5%的患者接受再灌注，而且相關(guān)方案隨意性大，缺乏規(guī)范性[5]，故在急性心肌梗死治療指南的基礎(chǔ)上規(guī)范中醫(yī)診療方案，明確中藥作用機制，提高中西醫(yī)結(jié)合治療水平是醫(yī)護人員面臨的重要問題。因此，本研究對當(dāng)歸四逆湯抗寒凝心脈型急性心肌梗死的治療作用進行分子機制預(yù)測性挖掘，從微觀生物層面篩選關(guān)鍵活性成分及靶點。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)庫建立 利用整合藥理學(xué)平臺[6](http://www.tcmip.cn/)中的中藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，結(jié)合2020年版《中國藥典》規(guī)范藥材命名及成分名稱，建立分子數(shù)據(jù)資料庫。檢索“當(dāng)歸”“細(xì)辛”“甘草”“白芍”“桂枝”“大棗”這些主要中藥，保留活性成分與靶點，完備數(shù)據(jù)庫。

1.2 藥物靶標(biāo)預(yù)測 利用TCMIP提取“當(dāng)歸”“細(xì)辛”“甘草”“白芍”“桂枝”“大棗”所含成分的化學(xué)分子指紋，并將其與Drug Bank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫中獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)批準(zhǔn)的治療冠心病心肌梗死藥物指紋進行比對，利用Tanimoto系數(shù)對結(jié)果進行評分，選定大于0.8者作為當(dāng)歸四逆湯方的潛在機制靶點[7]。

1.3 疾病、證候靶標(biāo)確定 以“myocardial infarction”作為疾病關(guān)鍵詞，在GeneCard(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)檢索全疾病相關(guān)靶標(biāo)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)轉(zhuǎn)換蛋白名稱，獲取基因名稱，通過Excel軟件去重，建立疾病數(shù)據(jù)庫。再以“myocardial infarction”為疾病關(guān)鍵詞，錄入整合藥理學(xué)平臺疾病、證候靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，關(guān)鍵詞為胸悶胸痛、手足厥冷、四肢麻木、乏力、短氣、苔薄白、脈浮緊等，提取相應(yīng)證候靶點信息。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析與可視化 通過整合藥理學(xué)平臺的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，對蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治?，選取中藥靶點-疾病基因的關(guān)鍵節(jié)點(hubs)作為當(dāng)歸四逆湯活性成分的潛在靶點，然后對關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進行通路富集分析，選取P值排名前20的通路,構(gòu)建完整的“中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),并進行可視化數(shù)據(jù)分析。通過David平臺(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對關(guān)鍵靶基因進行GO功能、KEGG富集分析，利用Jvenn[8](http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)在線繪圖獲取韋恩圖。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸四逆湯成分靶標(biāo) 當(dāng)歸四逆湯共包含1 661種成分，潛在靶標(biāo)2 728個。對潛在靶標(biāo)進行基因功能分析和通路富集分析，發(fā)現(xiàn)其功能大多與調(diào)控上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)控、NO生物合成過程的正調(diào)控、凋亡過程的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

2.2 心肌梗死疾病靶標(biāo)及相關(guān)基因 對全疾病相關(guān)潛在靶標(biāo)合并去重后，共獲得1 062個，其中與當(dāng)歸四逆湯密切相關(guān)的共同靶向基因共545個，主要在調(diào)控炎性因子、凝血因子-2(recombinant coagulation factor II，F(xiàn)2)[9]、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG)[10]、eNOS[11]、血管內(nèi)皮生長因子[12]、細(xì)胞凋亡蛋白酶[13]等方面共同調(diào)節(jié)發(fā)揮作用，見圖1。

圖1 心肌梗死疾病靶標(biāo)及相關(guān)基因韋恩圖Fig.1 Veen diagram for myocardial infarction disease targets and related genes

2.3 當(dāng)歸四逆湯抗心肌梗死候選基因的GO富集分析 表1顯示，當(dāng)歸四逆湯候選靶標(biāo)參與的通路主要涉及GTP酶正調(diào)控、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)肽信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)負(fù)調(diào)控、磷脂酰肌醇生物合成過程等方面。

表1 當(dāng)歸四逆湯抗心肌梗死候選基因的GO富集分析Tab.1 GO enrichment analysis of candidate genes of Danggui Sini Decoction against myocardial infarction

2.4 當(dāng)歸四逆湯抗心肌梗死核心靶標(biāo)的KEGG富集分析 表2顯示，核心靶標(biāo)主要涉及賴氨酸、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)、谷胱甘肽代謝、多種氨基酸和脂類代謝、逆轉(zhuǎn)錄失調(diào)等方面。

表2 當(dāng)歸四逆湯抗心肌梗死核心靶標(biāo)的KEGG富集分析Tab.2 KEGG enrichment analysis of core targets for Danggui Sini Decoction against myocardial infarction

2.5 當(dāng)歸四逆湯抗心肌梗死的“中藥-成分-靶點-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析 圖2顯示，當(dāng)歸四逆湯通過調(diào)控賴氨酸和孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)、谷胱甘肽代謝、多種氨基酸和脂類代謝、逆轉(zhuǎn)錄失調(diào)等方面，對GTP酶正調(diào)控、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)肽信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)負(fù)調(diào)控、磷脂酰肌醇生物合成過程等通路進行干預(yù)。

圖2 當(dāng)歸四逆湯抗心肌梗死的“中藥-成分-靶點-通路”多維網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Multi-dimensional network of “traditional Chinese medicines-components-targets-pathways” of Danggui Sini Decoction against myocardial infarction

3 討論

中藥的治療機制一直是中醫(yī)學(xué)者們探究的方向，其目的是為了更加精準(zhǔn)地靶向治療，進行“精準(zhǔn)醫(yī)療”，這與中醫(yī)理論中“辨證論治”體系不謀而合。“精準(zhǔn)醫(yī)療”是近年來在科學(xué)推動下新興的一種醫(yī)療模式[14]。精準(zhǔn)醫(yī)療下的心血管研究的理想目標(biāo)是解決非傳染性死亡的流行病，加強對人類健康和疾病的理解，促進科學(xué)發(fā)展并提高臨床研究效率[15]。而新興的高通量數(shù)據(jù)密集型生物醫(yī)學(xué)測定法的應(yīng)用[16]，例如DNA測序[17]、蛋白質(zhì)組學(xué)[18]和成像技術(shù)，揭示了疾病的機制在個體中存在較大差異，這引起了人們的關(guān)注，即個體之間的差異應(yīng)在多大程度上影響有關(guān)治療、監(jiān)測或預(yù)防個體疾病最佳方法的決策。實際上，許多疾病發(fā)展過程的潛在異質(zhì)性表明，必須針對個體的獨特生化、生理、適應(yīng)癥，進行“個性化”治療[19]。對冠心病的早期臨床研究發(fā)現(xiàn)，溫陽復(fù)脈方對寒凝心脈型心肌梗死具有較好的臨床療效[20]，本研究通過整合藥理學(xué)對中藥成分、證候要素、疾病靶點進行多層次研究，并從藥物自身出發(fā)，分析中藥-證候要素-疾病-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)，從分子角度解釋中醫(yī)療效內(nèi)涵。

Wu等[21]通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸四逆湯對寒凝心脈、瘀血阻絡(luò)的干預(yù)作用可能涉及調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、膽汁酸生物合成和丙酮酸代謝4個途徑；并且整體組方的協(xié)同作用要優(yōu)于單體藥物。本研究對組方候選靶標(biāo)與疾病進行關(guān)聯(lián)并以網(wǎng)絡(luò)可視化形式展現(xiàn)，并預(yù)測其可能靶標(biāo)和分子信號通路。結(jié)果表明，當(dāng)歸四逆湯通過調(diào)控賴氨酸、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)、谷胱甘肽代謝、多種氨基酸和脂類代謝、逆轉(zhuǎn)錄失調(diào)等方面，對GTP酶的正調(diào)控、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)肽信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)負(fù)調(diào)控、磷脂酰肌醇生物合成的過程等通路進行干預(yù)。此外，本課題組將繼續(xù)對關(guān)鍵該通路和靶標(biāo)進行基礎(chǔ)實驗驗證，以期深入挖掘當(dāng)歸四逆湯抗寒凝心脈型心肌梗死的作用機制。