劉 揚， 芮雪琳， 李嘉誠， 徐 莉， 楊 曄,2， 尹登科,2,3*

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.現(xiàn)代中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

炎性反應和氧化應激的產(chǎn)生是潰瘍性結腸炎發(fā)病的重要原因[1-2]，促炎因子與抑炎因子之間的失衡會影響潰瘍性結腸炎發(fā)生發(fā)展[3]。在潰瘍性結腸炎患者和動物模型中，活化的中性粒細胞會產(chǎn)生大量的活性氧，干擾細胞穩(wěn)態(tài)，導致細胞損傷和粘膜屏障通透性增加，從而加速和持續(xù)進行中的炎癥[4-5]。同時，氧化應激除了改變抗氧化產(chǎn)物，還會導致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等細胞因子的改變，對炎癥產(chǎn)生影響[6]。

桔梗具有良好的抗炎、抗氧化和增強免疫等生物學活性[7-8]，相關復方(如潰結湯[9]、參苓白術散[10]等)對潰瘍性結腸炎具有良好的治療作用。研究表明，桔梗皂苷D能通過改善腸道損傷和維持腸道完整性來減輕葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎炎癥[11]；桔梗多糖是桔梗的主要成分，具有良好的體外抗炎、抗氧化活性[12-13]，但它對潰瘍性結腸炎的治療作用尚不明確。因此，本實驗考察桔梗多糖干預DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠模型的作用，以期為相關天然藥物的開以及潰瘍性結腸炎的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雄性BALB/c小鼠36只，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自蘇州西山生物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2020-0009，實驗前適應性飼養(yǎng)1周，自由飲水進食，保持12 h/12 h晝夜節(jié)律，溫度(25±2)℃。動物實驗方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學倫理委員會審核通過，倫理編號為AHUCM-mouse-2021028。

1.2 試劑與藥物 桔梗購自安徽友信藥業(yè)有限公司(批號20210220)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為正品。葡聚糖硫酸鈉(大連美侖生物技術有限公司，批號J0118B)；柳氮磺吡啶腸溶片(上海信宜天平藥業(yè)有限公司，批號09201122)。BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司，批號21056736)；髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20210615、20210617、20210425)；TNF-α兔抗鼠多克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司，批號I06211896)；IL-1β、IL-10兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號BJ01046015、BJ09047697)。其余試劑為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 儀器 冷凍干燥機(德國Marin Christ公司)；DM2000熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；十萬分之一電子分析天平(美國奧豪斯公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 多糖提取 按照文獻[14]報道，將桔梗飲片在60 ℃下烘干至恒重，搗碎，過60目篩，取100 g粉末，加100 mL蒸餾水，在80 ℃下回流5次，每次2 h，紗布過濾，水提液合并，濃縮至每1 mL含1 g藥物，采用一步醇沉法，向濃縮液加入乙醇使其終體積分數(shù)達80%，在4 ℃下靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀得粗品，Sevag法除蛋白后凍干，得率為27%。苯酚硫酸法測定其含量為78%。

2.2 單糖組成分析 通過高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)(ICS-5000+高效離子色譜儀，美國戴安公司)，將多糖以三氟乙酸水解，采用Carbo PACTMPA10分析柱(2.0 mm×250 mm)分析；流動相H2O-200 mmol/L NaOH-200 mmol/L NaAc，進行三元梯度洗脫分離，再以脈沖安培檢測器分析單糖組成。

2.3 建模及給藥 小鼠隨機分為6組，分別為對照組、模型組、柳氮磺吡啶組(200 mg/kg 柳氮磺吡啶)及桔梗多糖低、中、高劑量組(100、200、400 mg/kg桔梗多糖)，每組6只，對照組小鼠灌胃給予正常飲用水，其余各組小鼠均灌胃給予3% DSS溶液，連續(xù)7 d。DSS末次給藥后第2天，給藥組小鼠再分別灌胃給予柳氮磺吡啶及不同劑量桔梗多糖，對照組、模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)7 d。

2.4 樣本收集 實驗結束前小鼠禁食過夜，在第15天摘眼球取血，血樣室溫放置30 min，3 000 r/min離心15 min，得血清，置于-80 ℃冰箱中保存。取血后小鼠頸椎脫臼致死，取結直腸，測量肛門到回盲瓣距離，取結腸中間干凈部位于4%多聚甲醛中進行固定，用于包埋切片，剩余部位置于液氮中保存，收集脾臟并稱定質量，計算脾臟指數(shù)。

2.5 疾病活動指數(shù)(DAI)評分 每天監(jiān)測小鼠體質量、糞便稠度、直腸出血總量、存活率，檢查潰瘍性結腸炎的發(fā)生情況。通過臨床評分系統(tǒng)(DAI)評估總體疾病嚴重程度[15]，公式為DAI評分=(體質量減輕評分+糞便性狀評分+便血評分)/3，標準見表1。

表1 DAI評分標準Tab.1 Criteria for DAI scoring

2.6 HE染色觀察小鼠結腸組織病理變化 將小鼠結腸組織固定在4%多聚甲醛24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm切片，采用HE染色，在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)結構變化，評估結腸損傷和炎癥情況。

2.7 小鼠結腸組織中MPO活性檢測 將小鼠結腸于冰上剪碎后，立即用玻璃勻漿器在冰上勻漿，BAC蛋白試劑盒檢測組織勻漿中蛋白濃度，相關試劑盒檢測MPO活性。

2.8 免疫組織化學法檢測小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-10表達 將小鼠結腸組織切片脫蠟、水合后，移入10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中煮沸15 min，過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，PBS漂洗，室溫下加入山羊血清孵育1 h，再分別加入TNF-α(1∶250)、IL-1β(1∶250)、IL-10(1∶250)抗體，在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，隨機抽取30個免疫組化切片視野，采用Image-pro Plus 6.0計算積分光密度值(IOD)。

2.9 小鼠血清及結腸組織中SOD活性和MDA水平檢測 取低溫保存的小鼠血清及冰上制備的組織勻漿，采用相關試劑盒檢測SOD活性、MDA水平。

3 結果

3.1 單糖組成 桔梗多糖主要由D-巖藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、半乳糖醛酸組成，比例為11.00∶1.00∶15.79∶17.48∶12.45∶5.19。

3.2 桔梗多糖對小鼠體質量及DAI評分的影響 如圖1所示，飲用DSS水溶液后，除對照組外其余各組小鼠體質量均迅速下降，停止飲用后該趨勢開始停止，并隨著時間延長出現(xiàn)上升趨勢，并且給藥組小鼠體質量上升趨勢高于模型組(P<0.05)；模型組小鼠DAI評分在停止飲用DSS后開始逐漸下降，而給藥組該評分低于模型組(P<0.05，P<0.01)。由此可知，桔梗多糖對潰瘍性結腸炎小鼠具有治療作用。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 各組小鼠體質量變化(A)和DAI評分Fig.1 Changes of mouse body weight(A) and DAI score(B) in each

3.3 桔梗多糖對小鼠結腸長度及脾臟指數(shù)的影響 如圖2A所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸長度縮短(P<0.01)，而各給藥組小鼠結腸長度增加(P<0.05，P<0.01)。如圖2B所示，模型組小鼠脾臟指數(shù)高于對照組(P<0.01)，而桔梗多糖各劑量組小鼠脾臟指數(shù)均低于模型組(P<0.05，P<0.01)。結腸長度縮短以及脾臟指數(shù)升高是衡量潰瘍性結腸炎嚴重程度的指標[16]，本實驗中潰瘍性結腸炎模型建立成功，并且桔梗多糖能改善潰瘍性結腸炎小鼠的結腸縮短和脾腫大。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組小鼠結腸長度(A)和脾臟指數(shù)Fig.2 Mouse colon lengths(A) and spleen indices(B) in each

3.4 桔梗多糖對小鼠結腸組織病理變化的影響 如圖3所示，對照組小鼠結腸黏膜、隱窩結構、腺體排列正常，組織結構完整，未見炎性浸潤；模型組小鼠結腸組織黏膜損傷，大量炎性細胞浸潤，隱窩結構嚴重變形，杯狀細胞丟失；桔梗多糖各劑量組小鼠腸組織形態(tài)逐漸改善，黏膜損傷減輕, 炎性細胞浸潤逐漸減少，杯狀細胞及其隱窩形態(tài)相對完整，并呈劑量依賴性。由此可知，潰瘍性結腸炎小鼠在接受桔梗多糖治療后，結腸病理損傷程度有所改善。

圖3 各組小鼠結腸組織病理變化(HE染色，×100)Fig.3 Pathological changes of mouse colon tissues in each group(HE staining,×100)

3.5 桔梗多糖對小鼠結腸組織中MPO活性及炎癥因子表達的影響 如圖4A～4D所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β表達升高(P<0.01)，抑炎因子IL-10表達降低(P<0.01)；與模型組比較，桔梗多糖各劑量組抑制了TNF-α、IL-1β表達(P<0.01)，促進了IL-10表達(P<0.05)。 如圖4E所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中MPO活性升高(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組及桔梗多糖各劑量組能抑制MPO活性的升高(P<0.05，P<0.01)。結腸中MPO的活性是中性粒細胞浸潤的標志，是評價炎癥程度的指標[17]，由此可知，桔梗多糖能通過減少中性粒細胞的浸潤以及調(diào)節(jié)促炎因子與抗炎因子的平衡來起到治療效果。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組小鼠結腸組織中MPO活性和炎癥因子表達(免疫組化，F(xiàn)ig.4 Activities of MPO and expressions of inflammatory factors in mouse colon tissues in each

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組小鼠血清與結腸組織中SOD活性和MDA水平Fig.5 Activities of SOD and levels of MDA in mouse serum and colon tissues in each

3.6 桔梗多糖對小鼠血清及結腸組織中氧化應激指標的影響 如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠血清與結腸組織中MDA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組及桔梗多糖各劑量組小鼠血清和結腸組織中的MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性升高(P<0.05，P<0.01)。MDA、SOD在氧化應激中發(fā)揮了關鍵作用，是氧化應激反應的重要標志[18]，由此可知，桔梗多糖能調(diào)節(jié)潰瘍性結腸炎小鼠體內(nèi)的氧化應激反應，通過抗氧化作用來起到治療效果。

4 討論

潰瘍性結腸炎是一種常見于腸道黏膜層的潰瘍性炎癥性疾病，與可發(fā)生在口腔到肛門的任何部位的克羅恩病不同，它一般只局限于結腸部位[19]。使用化學誘導劑DSS誘導小鼠實驗性結腸炎的模型已被廣泛使用，可誘發(fā)潰瘍性結腸炎患者常見的各種癥狀，包括體質量減輕、糞便松軟、腹瀉甚至直腸出血[20]。 本研究使用3% DSS誘導7 d建立小鼠潰瘍性結腸炎模型，發(fā)現(xiàn)成模后小鼠體質量降低，出現(xiàn)腹瀉便血癥狀，DAI評分升高；桔梗多糖干預后，小鼠體質量、DAI評分、結腸長度、脾腫大都明顯改善，并且結腸病理損傷隨著其劑量增加而減輕，表明該成分具有顯著的藥效。

目前，對潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制尚未明確，但大量研究表明，嚴重的炎性反應以及氧化應激水平的升高是影響本病進程的重要因素[21- 22]。細胞因子在潰瘍性結腸炎的炎性反應中發(fā)揮著重要作用，不同細胞因子發(fā)揮著促炎或抗炎作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1β表達升高，抑炎因子IL-10表達降低，并且結腸組織中MPO活性升高；桔梗多糖干預后，上述促炎因子水平降低，抑炎因子水平升高，兩者之間平衡得以恢復，MPO活性也有所降低，表明炎癥得到改善。因此，桔梗多糖對潰瘍性結腸炎的改善作用可能是通過調(diào)節(jié)促炎因子和抑炎因子之間的平衡緩解炎性反應實現(xiàn)的。

在潰瘍性結腸炎期間，組織中會產(chǎn)生大量活性氧，并且SOD等抗氧化酶活性會下降，導致氧化應激的發(fā)生，促進脂質過氧化，增加MDA水平，從而加劇和延長炎癥[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠結腸和血清中SOD活性降低，MDA水平升高，說明潰瘍性結腸炎小鼠氧化應激水平的升高不僅僅發(fā)生在結腸組織，體內(nèi)的氧化應激水平也同樣升高了；桔梗多糖干預后，潰瘍性結腸炎小鼠組織以及血清中SOD活性升高，MDA水平降低，表明該成分能平衡氧化與抗氧化介質，緩解脂質過氧化，降低結腸組織乃至體內(nèi)的氧化應激水平，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，桔梗多糖能通過抑制MPO活性和炎性反應，減少炎性細胞浸潤，下調(diào)促炎細胞因子TNF-α、IL-1β表達，上調(diào)抑炎因子IL-10表達，提高小鼠結腸組織及血清中SOD活性，降低MDA水平，緩解體內(nèi)氧化應激水平，從而發(fā)揮抗?jié)冃越Y腸炎的作用。