張 玥， 周 雪， 王彩云， 成忠均， 李海池， 葛發(fā)歡， 阮培均， 張 蜀*

(1.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700)

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效[1]，常用于治療癲癇抽搐、頭痛眩暈、肢體麻木、風(fēng)濕痹痛等癥[2-3]，主要成分有酚類及其苷類、有機酸類、甾醇類、多糖類等[4]，可用于治療頭暈、失眠、癲癇、抑郁癥、神經(jīng)衰弱、阿爾茨海默病、高血壓等疾病[5-11]。我國西南地區(qū)天麻可分為昭通天麻、貴天麻、西天麻[12]，貴州省畢節(jié)市是貴天麻主要產(chǎn)區(qū)，下轄七星關(guān)區(qū)、赫章、納雍、織金、大方等縣，其中大方天麻被國家質(zhì)檢局認(rèn)證為國家地理標(biāo)志保護產(chǎn)品[13]。

目前，對天麻的質(zhì)量評價大多采用外觀、個頭及天麻素、對羥基苯甲醇含量作為指標(biāo)[1]，不能全面反映該藥材整體療效。中藥指紋圖譜具有整體性、特征性強的優(yōu)勢，可較好地體現(xiàn)中藥物質(zhì)群整體效果[14]，但也存在信息模糊性等問題，故近年來已有研究人員結(jié)合模式識別方法，對中藥指紋圖譜實現(xiàn)數(shù)據(jù)降維、識別、分類。目前，關(guān)于不同產(chǎn)地[15]、變型[16]、加工炮制方法[17]天麻的研究大多集中于指紋圖譜，并采用簡單的聚類分析，尚未將指紋圖譜、多指標(biāo)定量、化學(xué)模式識別分析相結(jié)合。本實驗首次建立畢節(jié)天麻HPLC指紋圖譜，并進行天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A含量測定，再結(jié)合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘判別分析篩選差異性特征成分，以期為完善該藥材質(zhì)量評價體系提供更全面的參考。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；XS205 DualRange型電子分析天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；OLB-1210型水分測定儀(濟南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)；DK-410HTDS型超聲波清洗機(深圳市得康洗凈電器有限公司)；RS-FS1401型微型高速萬能試樣粉碎機(合肥榮事達(dá)小家電有限公司)；0.25 T/H型純水機(廣州市萊晟機械設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 天麻素(批號B1723054，純度≥98%)、對羥基苯甲醇(批號A1829056，純度99%)對照品均購自阿拉丁試劑有限公司；巴利森苷B(批號RFS-B05602103001，純度99%)、巴利森苷C(批號RFS-B08702011116，純度99%)、巴利森苷E(批號RFS-B09402103002，純度99%)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；巴利森苷A(批號P24S11F124204，純度≥98%)對照品購自上海源葉生物科技有限公司。21批天麻(編號S1～S21)來源于貴州省畢節(jié)市各產(chǎn)區(qū)，蒸軟干燥，經(jīng)畢節(jié)市中藥研究所的阮培均研究員鑒定為天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖，包括紅天麻、烏天麻、黃天麻，具體信息見表1。乙腈為色譜純(德國Merck公司)；磷酸為分析純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；水為屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 供試品溶液制備 藥材粉碎后過60目篩，精密稱取2.0 g，置于50 mL具塞玻璃錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W、頻率40 kHz)處理60 min，冷卻，60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，蒸餾水等體積稀釋，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A對照品適量，30%乙腈制成質(zhì)量濃度分別為0.083 0、0.069 4、0.084 5、0.076 0、0.027 3、0.207 0 mg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)- 0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，3.0%A；20～30 min，3.0%～4.0%A；30～35 min，4.0%～5.0%A；35～45 min，5.0%～10.1%A；45～60 min，10.1%～10.2%A；60～75 min，10.2%～14.0%A；75～85 min，14.0%A；85～88 min，14.0%～16.5%A；88～100 min，16.5%～17.5%A；100～105 min，17.5%～20.0%A；105～108 min，20.0%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm；進樣量14 μL。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液(編號S17)，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定6次，以7號峰為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于2.91%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批藥材(編號S16)6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，以7號峰為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于2.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取藥材(編號S17)1份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，以7號峰為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于2.62%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 圖譜生成及相似度評價 取21批樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004年版)》，以S1圖譜為參照，時間窗寬度0.3 min，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點校正及自動峰匹配后得到疊加圖譜，見圖1，共發(fā)現(xiàn)18個共有峰，見圖2。

圖1 21批樣品HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for twenty-one batches of samples

2.天麻素 3.對羥基苯甲醇 7.巴利森苷E 11. 巴利森苷B 13. 巴利森苷C 17. 巴利森苷A2.gastrodin 3.p-hydroxybenzylalcohol 7. parishin E 11. parishin B 13. parishin C 17. parishin A圖2 各成分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

選擇保留時間居中、峰面積較大、峰形良好、分離度理想的7號峰作為參照，通過與對照品色譜峰保留時間、紫外吸收光譜信息進行比對，共指認(rèn)了6個共有峰，分別為天麻素(2號峰，0.211 min)、對羥基苯甲醇(3號峰，0.394 min)、巴利森苷E(7 號峰，1.000 min)、巴利森苷B(11 號峰，1.473 min)、巴利森苷C(13 號峰，1.606 min)、巴利森苷A(17 號峰，1.935 min)。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004年版)，對21批樣品HPLC指紋圖譜進行相似度評價，結(jié)果見表2。由此可知，不同批次紅天麻與黃天麻相似度較高，表明兩者整體質(zhì)量較穩(wěn)定；烏天麻相似度較低，表明其質(zhì)量差異較大。

表2 21批樣品相似度Tab.2 Similarities of twenty-one batches of samples

2.2 各成分含量測定

2.2.1 溶液制備 分別按“2.1.1”“2.1.2”項下方法制備供試品、對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)- 0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，3.0%A；5～15 min，3.0%～5.0%A；15～22 min，5.0%A；22～25 min，5.0%～10.1%A；25～35 min，10.1%～10.2%A；35～45 min，10.2%～14.0%A；45～52 min，14.0%A；52～55 min，14.0%～16.5%A；55～63 min，16.5%～17.5%A；63～65 min，17.5%～20.0%A；65～70 min，20.0%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm；進樣量4 μL。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.5、2、4、8、14 μL，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A峰面積RSD分別為0.24%、0.65%、0.22%、0.29%、0.36%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取藥材(編號S1)1份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A峰面積RSD分別為 1.42%、0.64%、1.02%、1.38%、0.42%、0.39%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗 取藥材(編號S1)1份，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A峰面積RSD分別為0.66%、0.41%、0.44%、0.81%、0.44%、0.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取藥材(編號S17)1份，按100%水平精密加入對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定6次，計算回收率。結(jié)果，天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A平均加樣回收率分別為103.54%、102.16%、96.18%、97.67%、99.01%、95.77%，RSD分別為0.91%、1.51%、0.53%、1.02%、0.78%、0.99%。

2.2.4 樣品含量測定 取21批樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表4，可知不同批次樣品中各成分含量差異較大。

表4 各成分含量測定結(jié)果(Ⅰ)Tab.4 Results of content determination of various constituents(Ⅰ)

2.3 質(zhì)量評價

2.3.1 基于聚類分析、主成分分析、含量測定 采用SPSS 26.0軟件，以共有峰峰面積為變量，通過組間聯(lián)接平方歐式距離測度的方式進行聚類分析，結(jié)果見圖3。由此可知，20批樣品可聚為3類，來自大方縣西北部、七星關(guān)區(qū)東部的紅天麻(S7～S10)聚為1類，來自大方縣西部及南部、七星關(guān)區(qū)西部、織金縣、威寧縣的紅天麻和黃天麻(S11～S21)聚為1類，來自大方縣、威寧縣、赫章縣、七星關(guān)區(qū)、織金縣的烏天麻(S1～S6)聚為1類。另外，樣品(S7～S10)中各成分含量顯著高于其他品種及其他產(chǎn)區(qū)樣品中。

圖3 21批樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis plot for twenty-one batches of samples

采用SPSS 26.0軟件，以共有峰峰面積為變量進行主成分分析，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，提取前4個主成分，結(jié)果見表5。由此可知，前4個主成分的累積方差貢獻率為84.934%，能較好地代表指紋圖譜中的大部分信息，其中第一主成分累積貢獻率為50.529%，信息量最多，主要來自峰2、4、10～14、17；第二主成分信息主要來自峰6、8～9、15、18；第三主成分信息主要來自峰 1、7；第四主成分信息主要來自峰1、5～6。再采用SIMCA 14.1軟件繪制主成分得分圖，見圖4，可知21批樣品大致被分為3組，S7～S10(七星關(guān)區(qū)東部和大方縣西北部，紅天麻)在右下側(cè)聚為1組，S11～S21(大方縣西部及南部、七星關(guān)區(qū)東部、織金縣和威寧縣，紅天麻和黃天麻)在中間聚為1組，S1～S6(大方縣、威寧縣、赫章縣、七星關(guān)區(qū)和織金縣，烏天麻)在左上側(cè)聚為1組。

表5 主成分分析結(jié)果Tab.5 Results of principal component analysis

圖4 21批樣品得分圖Fig.4 Score plot for twenty-one batches of samples

2.3.2 基于正交偏最小二乘判別分析、含量測定 采用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析，模型累積解釋能力參數(shù)R2X、R2Y分別為0.881、0.755，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.669，表明模型穩(wěn)定可靠，可用于評價藥材質(zhì)量[18]，得分散點圖見圖5。由此可知，21批樣品被分為3類，而且使其進一步聚集，組間差異更明確。

圖5 正交偏最小二乘判別分析得分散點圖Fig.5 Score scatter plot for partial least squares discriminant analysis

再以VIP值>1.0為標(biāo)準(zhǔn)[19]，篩選出具有統(tǒng)計學(xué)意義的5個共有峰，結(jié)果見圖6，可知依次為峰17(巴利森苷A，VIP值2.81)、峰7(巴利森苷E，VIP值1.79)、峰2(天麻素，VIP值1.51)、峰11(巴利森苷B，VIP值1.46)、峰3(對羥基苯甲醇，VIP值1.10)，可作為質(zhì)量差異標(biāo)志物。

圖6 共有峰VIP值Fig.6 VIP values for common peaks

表6顯示，七星關(guān)區(qū)西部和大方縣西北部紅天麻(S7～S10)中各成分總含量最高，大方縣西部和南部、七星關(guān)區(qū)東部、織金縣及威寧縣紅天麻、黃天麻(S11～S21)中次之，各產(chǎn)地烏天麻(S1～S6)中最低。

表6 各成分含量測定結(jié)果(Ⅱ)Tab.6 Results of content determination of various constituents(Ⅱ)

續(xù)表6

3 討論

3.1 指紋圖譜與相似度分析 雖然烏天麻、紅天麻、黃天麻指紋圖譜的主要色譜峰基本一致，但其峰面積差異較大，表明三者所含成分相似，但含量有較大區(qū)別。通過相似度可區(qū)分烏天麻，而紅天麻、黃天麻其數(shù)值均大于0.9，具有相似的品質(zhì)。

3.2 指標(biāo)成分含量分析 21批天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A含量差異較大，但變化趨勢不同。本實驗采用上述6種成分含量作為天麻質(zhì)量控制指標(biāo)，優(yōu)于2020年版《中國藥典》(僅有天麻素、對羥基苯甲醇)。

3.3 化學(xué)模式識別分析 21批天麻聚類分析、主成分分析、OPLS-DA分析結(jié)果完全一致，可明顯地聚為3類，除烏天麻分為1類外，大方縣西北部及與其接壤的七星關(guān)區(qū)東部區(qū)域的紅天麻(S7～S10)也分為該類，并篩選得到5種差異性指標(biāo)成分。該區(qū)域為大方縣西北部中山丘陵區(qū)，大部分地勢為西北高東南低，海拔在1 400～1 600 m之間，當(dāng)?shù)丶t天麻(S7～S10)中6種成分平均總含量為29.808 mg/g，約是其他區(qū)域紅天麻、黃天麻(S11～S21)的2倍(18.201 mg/g)，烏天麻(S1～S6)的3倍(10.294 mg/g)，表明不同產(chǎn)地、變型藥材的質(zhì)量存在明顯差異。