江 立， 孫成遜， 田雪麗， 劉志遠， 張艷紅， 方絲怡

(1.云南大唐漢方制藥股份有限公司，云南 昆明 665099；2.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海 201203)

龍血竭片以龍血竭為主藥，加入微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等輔料后包衣制得，是云南大唐漢方制藥有限公司上市的結(jié)腸定位給藥制劑(國藥準(zhǔn)字Z20027068)，功效活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌，用于治療跌打損傷、瘀血作痛、婦女氣血凝滯、外傷出血、膿瘡久不收口，以及慢性結(jié)腸炎所致的腹痛、腹瀉等癥，臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著獨特。但目前龍血竭片執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)存在指標(biāo)成分單一、僅以溶散時限為其溶解釋放控制指標(biāo)、缺少溶出度檢查等不足，亟需深入研究。

因此，本實驗同時測定龍血竭片中龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮含量，比較該制劑在不同溶出介質(zhì)中的累積溶出度，繪制體外溶出曲線，模擬藥物體內(nèi)釋放，并通過相似度分析來比較不同批次之間工藝與釋放情況的差異，以期為其質(zhì)量控制和評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Aglient 1100型高效液相色譜儀(美國Aglient公司)；SQP型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；FRQ-1010HTD型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZRS-8型智能溶出試驗儀(天津大學(xué)無線電廠)。

1.2 試劑與藥物 龍血素A(批號111660-200402)、龍血素B(批號111558-201407)、7，4′-二羥基黃酮(批號111787-201002)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。龍血竭片(批號19205、19303、19305、19309、190313、19314，云南大唐漢方制藥有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純(斯百全化學(xué)有限公司，批號3HJ0031、3IA0009)；其余試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相水(含1.0%乙酸)(A)-乙腈(含1.0%乙酸)(B)，梯度洗脫(0～15 min，74%A，26%B；15.0～15.5 min，74%～62%A，26%～38%B；15.5～50 min，62%A，38%B；50.0～50.1 min，62%～5%A，38%～95%B；50.1～55.0 min，5%A，95%B；55.0～55.1 min，5%～74%A，95%～26%B；55.1～60 min，74%A，26%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm(龍血素A、龍血素B)、330 nm(7，4′-二羥基黃酮)；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮對照品2.62、4.60、2.12 mg至10 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取1 mL至10 mL量瓶中，加入稀釋液(流動相A、B比例1∶1)至刻度，搖勻，即得(每1 mL含龍血素A 0.026 2 mg、龍血素B 0.046 0 mg、7，4′-二羥基黃酮0.021 2 mg)。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，精密加入稀釋液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率240 W、頻率45 kHz)處理45 min，放涼，稀釋液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

2.3.1 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品、空白樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品、對照品溶液在同一位置出峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 按“2.2.1”項下方法制備貯備液，甲醇稀釋至6個質(zhì)量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進行回歸，得方程分別為龍血素AY=33.028X-39.751(R2=0.999 5)，線性范圍2.85～171.30 mg/mL；龍血素BY=27.510X-37.744(R2=0.999 9)，線性范圍4.99～299.70 mg/mL；7，4′-二羥基黃酮Y=32.264X-24.896(R2=0.999 2)，線性范圍2.05～81.84 mg/mL。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮峰面積RSD分別為0.89%、1.04%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮峰面積RSD分別為0.69%、0.88%、0.41%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

2.3.5.1 供試品溶液 取同一份供試品溶液，于0、7、15、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮峰面積RSD分別為0.31%、0.24%、0.54%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5.2 對照品溶液 分別將新配制、4 ℃冰箱下放置1個月后的對照品溶液在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮加樣回收率分別為91.97%、91.09%、96.88%，表明對照品溶液在1個月內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的供試品溶液6份，精密加入對照品適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮平均加樣回收率分別為101.1%、93.3%、106.8%，RSD分別為0.8%、1.0%、0.9%。

2.4 體外溶出度研究

2.4.1 測定方法 按照2020年版《中國藥典》四部通則(0931)腸溶制劑方法1，以0.1 mol/L鹽酸750 mL為溶出介質(zhì)，設(shè)定轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度(37.0±0.5)℃。精密稱取本品6片至溶出杯中，運轉(zhuǎn)2 h后加入0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液250 mL，2.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH后繼續(xù)運轉(zhuǎn)，重新計時，于5、15、30、60、90、120 min各取樣4 mL，補加同溫等量介質(zhì)，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算各時間點累積溶出度，以取樣時間為橫坐標(biāo)，平均累積溶出度為縱坐標(biāo)繪制溶出曲線。

2.4.2 酸中溶出度考察 精密稱取本品(批號190313)6片，加入0.1 mol/L鹽酸中轉(zhuǎn)動2 h后取樣，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，按“2.4.1”項下方法測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮累積溶出度。結(jié)果，該制劑在0.1 mol/L鹽酸中未崩解，而且在2 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)溶出，符合相關(guān)規(guī)定。

2.4.3 溶出介質(zhì)篩選

2.4.3.1 緩沖液pH 調(diào)節(jié)緩沖液pH至6.8、7.4、8.0，按“2.4.1”項下方法測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮累積溶出度，結(jié)果見圖2。本品為pH依賴型結(jié)腸溶定位給藥制劑，其pH為6.8時溶出量極少，而在緩沖液pH為8.0、7.4的溶出介質(zhì)中，上述3種成分累積溶出度均無顯著差異，在pH為8.0時略高。

圖2 緩沖液pH對各成分累積溶出度的影響Fig.2 Effects of buffer solution pH on the accumulative dissolution rates of various constituents

2.4.3.2 十二烷基硫酸鈉(SDS)用量 調(diào)節(jié)pH至8.0，分別加入0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0% SDS，按“2.4.1”項下方法測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮累積溶出度，結(jié)果見圖3，可知各成分累積溶出度隨著SDS用量增加而升高。由于SDS用量要求不得大于0.5%，故選擇0.5%SDS作為增溶劑。

圖3 SDS用量對各成分累積溶出度的影響Fig.3 Effects of SDS consumption on the accumulative dissolution rates of various constituents

2.4.4 驗證試驗 按“2.4.1”項下方法測定5批樣品中龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮累積溶出度，結(jié)果見表1。由此可知，第1個取樣時間點各成分累積溶出度RSD為15.6%，小于20%；第2個至最后1個取樣時間點其RSD在2.6%～7.2%之間，小于10%，表明本品質(zhì)量及其制備工藝穩(wěn)定性良好。

表1 各成分累積溶出度測定結(jié)果Tab.1 Results of accumulative dissolution rate determination of various constituents

2.4.5 相似度分析

2.4.5.1 各成分溶出特性 取同一批龍血竭片(批號190309)，按“2.4.1”項下方法測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮累積溶出度，繪制溶出曲線(圖4)，再采用相似因子(f2)法比較各成分溶出的同步性。結(jié)果，龍血素B與龍血素A的f2為76.3，7，4′-二羥基黃酮與龍血素A的f2為26.5，表明前兩者溶出具有較好的同步性，而后兩者溶出同步性較差。

圖4 各成分體外溶出曲線(Ⅰ)Fig.4 In vitro dissolution curves for various constituents(Ⅰ)

2.4.5.2 各批次樣品溶出特性 取5批樣品，按“2.4.1”項下方法測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮累積溶出度，繪制溶出曲線(圖5)，再采用相似因子(f2)法比較各成分溶出差異，以樣品(批號190303)為對照，計算其他4批樣品f2，結(jié)果見表2。由此可知，f2均大于50，表明不同批次樣品中上述3種成分溶出度無顯著差異，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

表2 各成分f2測定結(jié)果(n=5)Tab.2 Results of f2 determintion of various constituents(n=5)

圖5 各成分體外溶出曲線(Ⅱ)Fig.5 In vitro dissolution curves for various constituents(Ⅱ)

3 討論

本實驗結(jié)合文獻[1-4]，對龍血竭中主要成分龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素A、劍葉龍血素C和7，4′-二羥基黃酮含量進行測定，發(fā)現(xiàn)劍葉龍血素A、劍葉龍血素C較低，故在原有相關(guān)方法的基礎(chǔ)上，建立HPLC法同時測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮含量。再選取不同pH緩沖液進行溶出度比較，并對增溶介質(zhì)加入量進行考察。結(jié)果，龍血竭片中龍血竭累積溶出量達70%以上，符合2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法合理可行。

隨著中藥質(zhì)量控制技術(shù)的發(fā)展，溶出度測定已經(jīng)逐漸應(yīng)用于中藥制劑處方篩選研究中[5-10]。中藥固體制劑是一個復(fù)雜體系，其溶出度受多種因素干擾，并且活性成分較多[11-13]，故多指標(biāo)檢測可更好地反映不同成分之間的相互影響和溶出差異[14-15]。本實驗在研究龍血竭片藥效基礎(chǔ)、作用機制的基礎(chǔ)上，同時測定龍血素A、龍血素B、7，4′-二羥基黃酮溶出度，符合中藥多成分、多靶點、多途徑的特點，并可為全面提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定堅實基礎(chǔ)。