王 麗， 黃一聆， 房 偉

(1.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 商丘 476000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

柚皮素是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗纖維化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、預(yù)防動脈粥樣硬化等活性[1-3]，但該成分屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中II類藥物，口服吸收程度較差(吸收率僅約為5.8%)[1]，臨床應(yīng)用受到較大限制。目前，王章姐等[4]制備的柚皮素自微乳中乳化劑及助乳化劑用量較大，可能存在安全隱患；王元文[5]制備的柚皮素脂質(zhì)體載藥量僅為2.44%；趙涵等[6]制備的柚皮素納米晶體粒徑達(dá)到(400.7±6.9)nm，可能會限制其生物利用度提高程度[7]。

聚合物膠束是由兩親性聚合物的親水性鏈段向水中伸展形成膠束的殼，而疏水性鏈段包裹難溶性藥物后聚集形成膠束的核，從而形成的一種殼-核型的球形聚集體，粒徑一般在10～100 nm之間[8-10]，具有良好的穩(wěn)定性和較高的載藥量[10]，并且其制備工藝簡單，可有效提高生物利用度及藥效[11-12]。聚乙二醇單甲醚-聚乳酸嵌段共聚物(mPEG-PLA)是一種生物相容性良好，可生物降解的聚合物載體，被FDA批準(zhǔn)用于藥物制劑、醫(yī)學(xué)手術(shù)等領(lǐng)域，安全性較高。本實驗制備柚皮素mPEG-PLA聚合物膠束，并對其體內(nèi)藥動學(xué)進(jìn)行研究，以期為該成分新型口服制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料

AR2140型電子天平[配置防風(fēng)罩，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；安捷倫1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HJ-4A型磁力攪拌器(山東歐萊博儀器有限公司)；VORTEX-5型渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；RE5003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州科坤儀器設(shè)備有限公司)；FD-1C-50型真空冷凍干燥機(江蘇恒敏儀器制造有限公司)；HNDK400型氮氣吹掃儀(上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

柚皮素原料藥(批號191005，純度97%，蘇州甫路生物科技有限公司)；柚皮素對照品(批號200110-2，純度98.3%，上海純優(yōu)生物科技有限公司)；mPEG-PLA(批號20190630，分子量10 000 Da，山東岱罡生物科技有限公司)；甘露醇(批號D2108280，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

SD大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，雌雄兼用，購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮素含量測定

2.1.1 色譜條件 Waters-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇-水(65∶35)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長288 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 稱取柚皮素對照品50 mg，溶于100 mL甲醇中，制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的貯備液，取適量用流動相依次稀釋至20、10、5、1、0.5、0.1 μg/mL，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取聚合物膠束混懸液1 mL至100 mL量瓶中，適量甲醇超聲處理2 min，取5 mL至10 mL量瓶中，流動相定容，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項下不同質(zhì)量濃度對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=31.047 3X+1.088 5(r=0.999 9)，在0.1～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 方法學(xué)考察 平行制備6份聚合物膠束供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得柚皮素峰面積RSD為1.70%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一份供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素峰面積RSD為1.34%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.1.2”項下0.1、5、20 μg/mL對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得柚皮素峰面積RSD分別為0.93%、0.34%、0.22%，表明儀器精密度良好。取9份聚合物膠束混懸液至100 mL量瓶中，每份均為0.5 mL，分為3組，分別加入“2.1.2”項下貯備液1.0、1.25、1.5 mL，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素平均回收率加樣分別為99.31%、100.66%、99.85%，RSD分別為0.94%、1.13%、0.88%。

2.2 包封率、載藥量測定 取1 mL聚合物膠束混懸液至超濾管中(截留分子量為10 000 Da)，8 000 r/min離心10 min，收集續(xù)濾液，測定游離藥量(W游離)。取1 mL聚合物膠束混懸液至100 mL量瓶中，適量甲醇超聲處理2 min，取5 mL至10 mL量瓶中，流動相定容，測定總藥量(W總)，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率=(1-W游離/W總)×100%、載藥量=[(W總-W游離)/(W總+W總載體)×100%]，其中W總載體為載體總用量。再平行制備3批聚合物膠束，測得平均包封率為(86.76±1.81)%，載藥量為(12.71±0.53)%。

2.3 粒徑、Zeta電位測定 取0.5 mL聚合物膠束，蒸餾水稀釋50倍，取3 mL至Master-sizer型粒度分析儀中測定其粒徑、Zeta電位。

2.4 聚合物膠束制備 采用溶劑揮發(fā)法[9]制備。取柚皮素原料藥25 mg，溶于無水乙醇中，再取處方量mPEG-PLA聚合物，溶于一定體積蒸餾水中，在轉(zhuǎn)速1 000 r/min、溫度45 ℃條件下緩慢加到柚皮素乙醇溶液中，在一定溫度下持續(xù)旋蒸一定時間，0.22 μm微孔濾膜過濾，補充蒸餾水至原始水相體積，即得，密封。

2.5 單因素試驗

2.5.1 mPEG-PLA用量 固定柚皮素用量25 mg，有機溶劑用量5 mL，水相體積20 mL，旋蒸溫度30 ℃，旋蒸時間3.5 h，考察mPEG-PLA用量100、125、150、175 mg對包封率、載藥量、粒徑的影響，結(jié)果見表1。由此可知，隨著mPEG-PLA用量增加，包封率呈逐漸升高的趨勢，而載藥量逐漸降低，粒徑逐漸減??；在175 mg時包封率升高、粒徑降低程度均不明顯，但載藥量明顯降低。最終確定，mPEG-PLA用量為150 mg。

表1 mPEG-PLA用量對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)Tab.1 Effects of mPEG-PLA consumption on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.2 有機溶劑體積 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg、水相體積20 mL，旋蒸溫度30 ℃，旋蒸時間3.5 h，考察有機溶劑體積1、3、5、7 mL對包封率、載藥量、粒徑的影響，結(jié)果見表2。由此可知，有機溶劑體積對包封率、載藥量無明顯影響，但隨著其增加粒徑有減小趨勢。最終確定，有機溶劑體積為3 mL。

表2 有機溶劑體積對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)Tab.2 Effects of organic solvent volume on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.3 水相體積 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有機溶劑體積3 mL，旋蒸溫度30 ℃，旋蒸時間3.5 h，考察水相體積10、15、20、25 mL對包封率、載藥量、粒徑的影響，結(jié)果見表3。由此可知，隨著水相體積增加包封率、載藥量均呈先升高后降低的趨勢，而粒徑呈逐漸減小的趨勢；在10 mL時包封率不足80%，粒徑大于100 nm；在25 mL時包封率降低，可能是由于有機相擴散至水相的速度較快，聚合物來不及包載藥物所致[13]。最終確定，水相體積為20 mL。

表3 水相體積對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)Tab.3 Effects of aqueous volume on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.4 旋蒸溫度 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有機溶劑體積3 mL，水相體積20 mL，旋蒸時間3 h，考察旋蒸溫度20、25、30、35、40 ℃對包封率、載藥量、粒徑的影響，結(jié)果見表4。由此可知，旋蒸溫度對膠束粒徑影響不大，但隨著其增加包封率、載藥量先逐漸升高后降低，可能是由于高溫會影響mPEG-PLA穩(wěn)定性、聚合物膠束形成及穩(wěn)定性所致[14-15]。最終確定，旋蒸溫度為30 ℃。

表4 旋蒸溫度對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)Tab.4 Effects of rotary evaporation temperature on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.5 旋蒸時間 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有機溶劑體積3 mL，水相體積20 mL，旋蒸溫度30 ℃，考察旋蒸時間2、2.5、3、3.5、4 h對包封率、載藥量、粒徑的影響，結(jié)果見表5。由此可知，隨著旋蒸時間延長，包封率、載藥量逐漸升高后趨緩，可能是由于體系中有機溶劑未能完全除去，從而破壞膠束所致。另外，聚合物膠束自組裝過程需一定時間[14]，但旋蒸時間過長時粒徑增大，包封率、載藥量有所下降。最終確定，旋蒸時間為3.5 h。

表5 旋蒸時間對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)Tab.5 Effects of rotary evaporation time on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.6 驗證試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定最優(yōu)制備工藝為柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有機溶劑體積3 mL，水相體積20 mL，旋蒸溫度30 ℃，旋蒸時間3.5 h。按上述優(yōu)化工藝平行制備3批聚合物膠束(圖1)，平均包封率為86.76%，載藥量為12.71%，平均粒徑為68.27 nm，PDI為0.181，粒徑分布、Zeta電位見圖2～3，可知兩者分別為20～100 nm、-18.6 mV。

圖1 聚合物膠束外觀Fig.1 Appearance of polymeric micelles

圖2 聚合物膠束粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of polymeric micelles

圖3 聚合物膠束Zeta電位Fig.3 Zeta potential of polymeric micelles

2.7 形態(tài)觀察 取聚合物膠束混懸液適量，蒸餾水稀釋50倍后滴至銅網(wǎng)上，自然晾干后在透射電鏡(TEM)下觀察，見圖4，首先發(fā)現(xiàn)固定膠形態(tài)，繼續(xù)放大至15 000倍時即可發(fā)現(xiàn)具體形態(tài)，并且之間無粘連現(xiàn)象。

圖4 聚合物膠束TEM圖Fig.4 TEM image for polymeric micelles

2.8 凍干粉制備 取聚合物膠束混懸液適量，加入6%甘露醇振蕩溶解，取3 mL至西林瓶中，平行制備若干份，置于-50 ℃冰箱中冷凍2 d，再迅速置于-25 ℃真空冷凍干燥機中3 d，即得，外觀見圖5，可知其外觀飽滿均一，無塌陷現(xiàn)象。復(fù)溶后，測得凍干粉包封率為81.79%，載藥量為12.14%，平均粒徑為79.65 nm，PDI為0.203，Zeta電位為-15.62 mV。

圖5 凍干粉外觀Fig.5 Appearance of lyophilized powder

2.9 體外釋藥研究 取柚皮素及其聚合物膠束凍干粉適量(均含8 mg柚皮素)，采用空白釋藥介質(zhì)制備混懸液后置于溶脹后透析袋中(截留分子量8 000～12 000 Da)。文獻(xiàn)[16]報道，柚皮素在水中的溶解度為74.52 μg/mL，在500 mL純化水中可達(dá)漏槽條件，故本實驗選擇釋藥介質(zhì)為500 mL純化水(超聲處理20 min)，轉(zhuǎn)速、溫度分別設(shè)置為100 r/min、(37±1)℃，于0、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24、48 h各取樣4 mL，并補加4 mL純化水，0.45 μm微孔濾膜過濾，測定累積釋放度，結(jié)果見圖6。由此可知，不同時間點聚合物膠束累積釋放度均高于原料藥，24 h內(nèi)分別為59.17%、31.83%，48 h內(nèi)分別為71.05%、33.67%。

圖6 柚皮素體外釋放曲線(n=6)Fig.6 In vitro release curves for naringenin(n=6)

2.10 體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.10.1 分組、給藥與取血 取柚皮素及其聚合物膠束凍干粉末適量，0.5%CMC-Na制成混懸液(柚皮素含量為3 mg/mL)。12只大鼠隨機分為2組，每組6只，分別灌胃給予相應(yīng)藥物(20 mg/kg)，再用0.5 mL生理鹽水沖洗灌胃針使藥物完全進(jìn)入胃內(nèi)。原料藥組大鼠于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h眼眶采血各約0.3 mL，置于肝素化離心管中，聚合物膠束組大鼠再增加12 h的采血點，血液3 000 r/min離心3 min，取上層血漿，密封后保存于冰箱冷凍層中。

2.10.2 樣品處理 將“2.10.1”項下血漿室溫解凍后精密量取100 μL，加入1.5%甲酸50 μL，密封，渦旋60 s，加入乙酸乙酯1 mL，渦旋60 s，4 ℃、10 000 r/min離心8 min，轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，設(shè)置溫度為40 ℃，氮氣吹干，得殘渣，加入100 μL甲醇，渦旋10 s復(fù)溶，HPLC法測定柚皮素血藥濃度。

2.10.3 方法學(xué)考察 取柚皮素對照品適量，甲醇稀釋至1 200、600、300、100、50、20 ng/mL，分別精密吸取100 μL，40 ℃氮氣吹干，得殘渣，加入100 μL空白血漿，渦旋10 s復(fù)溶，即得血漿對照品溶液，按“2.10.2”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以柚皮素峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.130 8X+7.951 4(r=0.990 5)，在20～1 200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取20、300、1 200 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下各進(jìn)樣測定6次，測得柚皮素峰面積RSD分別為9.07%、3.17%、5.14%，表明儀器精密度良好。取聚合物膠束灌胃給藥1 h后的樣品，于0、2、4、8、16、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素峰面積RSD為10.24%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取1 200、300、20 ng/mL血漿對照品溶液，按“2.10.2”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素加樣回收率分別為91.69%、97.25%、94.88%，RSD分別為4.81%、7.26%、5.63%。

2.10.4 結(jié)果分析 柚皮素血藥濃度-時間曲線見圖7。t1/2、tmax組間比較采用非參數(shù)法秩和檢驗；Cmax、AUC0～t、AUC0～∞經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，組間比較采用DAS軟件進(jìn)行方差分析、雙單側(cè)t檢驗，結(jié)果見表6。由此可知，與原料藥比較，聚合物膠束tmax、t1/2延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對生物利用度提高至4.38倍。

圖7 柚皮素血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.7 Plasma concentration-time curves for naringenin(n=6)

表6 柚皮素主要藥動學(xué)參數(shù)Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for

3 討論

體外釋藥研究結(jié)果顯示，柚皮素mPEG-PLA聚合物膠束增加了藥物的釋放量，可能是一方面膠束增加了疏水性藥物的表面潤濕性；另一方面藥物粒徑很小，大大增加了與水相的接觸機會[17]；在6 h內(nèi)約有35%的藥物釋放，可能是吸附在膠束表層的藥物及部分游離藥物釋放所致(本實驗未將游離藥物除去)；6～48 h出現(xiàn)緩釋現(xiàn)象，可能是藥物與載體之間發(fā)生相互作用[18-19]，使前者穩(wěn)定地存在于膠束內(nèi)部，釋放阻力較大。另外，雖然柚皮素mPEG-PLA聚合物膠束在不同時間點的釋放度均高于原料藥，但48 h內(nèi)累積釋放度僅為71.05%，仍未達(dá)到完全釋放，可能會影響吸收程度。

體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，柚皮素mPEG-PLA聚合物膠束tmax、Cmax、t1/2、AUC0～t、AUC0～∞與原料藥相比均有顯著差異(P<0.01)，表明該劑型明顯改變了柚皮素藥動學(xué)[12]；前者tmax延后，可能是膠束緩釋作用所致，同時也影響了藥物進(jìn)入血液的循環(huán)時間，使t1/2發(fā)生顯著性變化；Cmax升高，可能是因為膠束增加了藥物溶解度[12,20]，提高了藥物釋放度；口服生物利用度提高至4.38倍，也與膠束對藥物的保護(hù)作用有關(guān)，使藥物免受外界環(huán)境的破壞[13]，增加了穩(wěn)定性；較大的比表面積可使藥物與胃腸道充分接觸，有利于進(jìn)入血液循環(huán)。

綜上所述，本實驗為柚皮素高效口服制劑的開發(fā)提供了借鑒，但其藥效學(xué)能否得到提高尚不明確，還需作進(jìn)一步研究。