沈麗麗，李倩倩，陳玥彤，陳錦飛

1.江蘇省南通市海門區(qū)人民醫(yī)院（南通大學(xué)附屬海門醫(yī)院）腫瘤科，江蘇南通226100；2.南京醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京210006；3.南京大學(xué)附屬泰康仙林鼓樓醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京210046

乳腺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害廣大女性的健康[1]，尤其是晚期乳腺癌患者，生存質(zhì)量欠佳。對(duì)于晚期乳腺癌，骨是最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，癌細(xì)胞通過(guò)局部浸潤(rùn)，滲入血管、淋巴管，隨循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到骨，定居并增殖引起溶骨性骨損傷，進(jìn)而引起頑固性骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、功能障礙等一系列骨相關(guān)事件，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，尋找作用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的特異性生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。

microRNA-34(miR-34)家族是高度保守的miRNA，廣泛存在于哺乳動(dòng)物中，包含3個(gè)同源基因，分別為miR-34a、miR-34b、miR-34c[2]。有研究顯示，miR-34a在一些常見腫瘤中發(fā)生表現(xiàn)遺傳失活，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡、DNA修復(fù)、血管生成等在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用，包括乳腺癌[3-5]。另外，Zhao FL等[6]研究及Ell B等[7]研究均發(fā)現(xiàn)某些miRNA與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a的缺失會(huì)激活成骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移。我們猜測(cè)，miR-34a與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移存在一定相關(guān)性。該研究以2015年11月—2017年3月南京市第一醫(yī)院收治的女性乳腺癌患者60例為研究對(duì)象，探討miR-34a與乳腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集南京市第一醫(yī)院收治的女性乳腺癌患者60例，包括30例乳腺癌不伴骨轉(zhuǎn)移的患者（BCa組），30例乳腺癌伴骨轉(zhuǎn)移患者（BCb組），所有患者均為根治術(shù)后，已有明確病理診斷，入組后進(jìn)行抽血取樣。并收集患者的個(gè)人信息及病理信息，包括病理類型、腫瘤大小(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(N)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況(M)、受體表達(dá)情況(ER、PR、HER-2等)、Luminal分型、生存情況。對(duì)照組為30名健康體檢女性，既往無(wú)腫瘤、各類乳腺疾病、高血壓病、糖尿病等疾病史。

1.2 方法

①?gòu)募{入樣本前臂靜脈采血5 mL，血樣靜置1 h后離心處理，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心10 min分離血漿，-80℃保存。②采用TRIzol試劑(Invitrogen/Life Technologies Carlsbad,CA,USA)從血漿中提取總RNA，-70℃保存。③該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的RT引物序列和PCR引物均由廣州瑞博設(shè)計(jì)提供，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)血清中miR-34a、cel-miR-39（外參）的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量時(shí)，以外參基因miR-39的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)化，計(jì)算△Ct并通過(guò)公式2-△Ct的方法計(jì)算miR-34a的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)以（±s）表示，并采用Prism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)miR-34a的表達(dá)進(jìn)行ROC曲線分析和Kaplan-Meier生存曲線分析，了解其與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本資料

共納入60例乳腺癌患者，平均年齡53.9歲，其中有24例患者未絕經(jīng)，有43例患者腫瘤直徑＞2 cm，41例患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，35例患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另外，Luminal分型情況如下：A型8例，B型27例，HER-2過(guò)表達(dá)型7例，基底樣型18例。

2.2 RT-PCR檢測(cè)miR-34a表達(dá)水平

與正常對(duì)照組(1.14±0.58)相比，miRNA-34a在乳腺癌(0.21±0.05)及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移(0.32±0.16)患者血清中的表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，在乳腺癌不伴骨轉(zhuǎn)移患者組（BCa組）中表達(dá)水平略低于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者組（BCb組），但兩組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量，見圖1。

圖1 miR-34a在乳腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血清中的表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組

60例乳腺癌患者血清miR-34a表達(dá)水平以ROC曲線診斷臨界值0.247 15為界。基于該臨界值，將60例樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分別包含17例和43例樣本。收集研究對(duì)象的生存情況，高表達(dá)組的平均生存時(shí)間為136個(gè)月，低表達(dá)組的平均生存時(shí)間為70個(gè)月，低表達(dá)組患者的預(yù)后明顯差于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(HR=0.106(0.028～0.400)，P=0.001)]，見圖2。

圖2 miR-34a表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)

應(yīng)用單因素分析miR-34a表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，見表1。miR-34a在乳腺癌組織中的表達(dá)量與以下幾個(gè)臨床病理特點(diǎn)顯著相關(guān)：腫瘤大小(P=0.003)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)(P=0.001)、雌激素受體狀態(tài)(P=0.003)、人類上皮生長(zhǎng)因子-2的表達(dá)狀態(tài)(P=0.014)、Luminal分型(P=0.004)。但與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、PR狀態(tài)等無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05）。將腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)進(jìn)一步進(jìn)行分層分析，見圖3。T2或T3患者血清中miR-34a表達(dá)水平顯著低于T1患者的表達(dá)水平，應(yīng)用Pearson相關(guān)性進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)水平與腫瘤大小分期呈負(fù)相關(guān)（P=0.008）。而在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)患者的血清中，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 miR-34a在乳腺癌不同N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）患者的血清中表達(dá)水平無(wú)明顯差異

表1 乳腺癌患者miR-34a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖3 miR-34a在乳腺癌T2/T3患者的血清中表達(dá)水平顯著低于T1患者

3 討論

miR-34a是一類高度保守的非編碼RNA，也是一種抑癌基因，能與靶基因的非編碼區(qū)結(jié)合，包括Bcl-2、SIRT1、Wnt1、Notch1等，以降解靶向mRNA或阻止其翻譯，通過(guò)靶基因表達(dá)的變化影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡等[8-10]。另外，我們知道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中是一重要進(jìn)程，與TGFβ1、Wnt和Notch信號(hào)通路相關(guān)，并且與Snail、Slug、Twist和ZEB1/2等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控相關(guān)[11-12]。同時(shí)，Li G等[13]發(fā)現(xiàn)miR-34a在乳腺中低表達(dá)，并靶向調(diào)控TPD52基因高表達(dá)，進(jìn)而影響TGF-β信號(hào)通路；Si W等[10]miR-34a直接調(diào)控下游Wnt1基因表達(dá)，進(jìn)而與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相互作用；Helge S等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）與miR-34相互調(diào)控，形成負(fù)調(diào)節(jié)環(huán)。由此推測(cè)，miR-34a可通過(guò)上述途徑在乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，乳腺癌細(xì)胞一旦在EMT過(guò)程中獲得間質(zhì)特性，更容易從原位腫瘤中遷移，從而導(dǎo)致乳腺癌浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這與該研究結(jié)果契合，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中miR-34a表達(dá)水平與腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，且其表達(dá)水平與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，與既往報(bào)道的結(jié)果也一致[15-16]。

該研究還發(fā)現(xiàn)，miR-34a高表達(dá)組的平均生存時(shí)間為136個(gè)月，低表達(dá)組的平均生存時(shí)間為70個(gè)月，低表達(dá)組患者的預(yù)后明顯差于高表達(dá)組（P=0.001）。Kim DM等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在局部晚期三陰性乳腺癌患者中，miR-34a高表達(dá)的總生存期50個(gè)月較低表達(dá)組的36個(gè)月長(zhǎng)，具有一定的生存獲益趨勢(shì)（P=0.059）。但在早期三陰性乳腺癌患者中，miR-34a的表達(dá)水平與生存情況并無(wú)顯著相關(guān)性（P=0.580）。另外，Recep B等[18]分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)包括61例三陰性乳腺癌患者的數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，miR-34a高表達(dá)患者的生存率顯著高于miR-34a低表達(dá)患者(96個(gè)月vs 54個(gè)月，P=0.014 1)。以上文獻(xiàn)提示miR-34a水平與乳腺癌患者預(yù)后存在正相關(guān)可能，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量篩選優(yōu)勢(shì)人群。三陰性乳腺癌患者相關(guān)研究中，Recep B等[18]發(fā)現(xiàn)miR-34a通過(guò)與eEF2K相互作用，進(jìn)而對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生影響。真核延伸因子激酶-2（eEF2K）屬于特殊的蛋白激酶-α-激酶小家族，參與腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、自噬、凋亡、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程的調(diào)控,研究發(fā)現(xiàn)，eEF2K表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[19]。eEF2K或許就是miR-34a影響乳腺癌患者預(yù)后的作用途徑之一。但該研究樣本量較小，未進(jìn)一步分析在不同分子分型的乳腺癌患者中miR-34a表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性，且未能進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，這有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

該研究擬尋找乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物。在骨骼微環(huán)境中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞維持了正常的骨重建和完整性。骨轉(zhuǎn)移病灶的存在破壞了正常骨微環(huán)境的平衡，進(jìn)一步促進(jìn)骨破壞和腫瘤的進(jìn)展[20]。有研究報(bào)道，miR-34a通過(guò)抑制破骨細(xì)胞形成和Tgif2來(lái)阻斷骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移[21]，相反，miR-34a的缺失會(huì)激活成骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移。但是，該研究發(fā)現(xiàn)血清中miR-34a的表達(dá)水平與骨轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)性，這可能與該研究樣本量小有關(guān)，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

該研究還存在一些不足：①該研究樣本量少，可能導(dǎo)致偏倚。②該研究未進(jìn)行作用機(jī)制的研究。將來(lái)我們會(huì)以該研究結(jié)論進(jìn)一步開展大樣本的深入分析探討，探討miR-34a與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)性的作用機(jī)制，為乳腺癌患者的診治帶來(lái)新的希望。

綜上所述，miR-34a在乳腺癌患者（包括發(fā)生骨轉(zhuǎn)移及未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移）血清中均呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與雌激素受體狀態(tài)、人類上皮生長(zhǎng)因子-2的表達(dá)狀態(tài)、Luminal分型、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)，與乳腺癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)，但miR-34a與乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性并不顯著。以上均提示miR-34a在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，miR-34a可以作為一種腫瘤標(biāo)志物，在臨床工作中用于乳腺癌的診斷及預(yù)后評(píng)估，具有重要的臨床價(jià)值。