侯 靜，黃 勇，黎 理，王素娥，蔡 毅

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001）

斑地錦（Euphorbia maculataL.）是大戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（Euphorbia）地錦草組藥用植物，有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃等功效；可用于治療痢疾、泄瀉、尿血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等疾?。?］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其也具有保肝、治療宮頸癌、抗腫瘤、抗高血糖、抑制胃癌細(xì)胞增殖、抗骨質(zhì)疏松及抗細(xì)胞毒性等藥理作用［2-14］。地錦草組植物有10 種［15］，分布在廣西的有6 種，其中斑地錦、匍匐大戟（Euphorbia prostrataAit.）、臺西地錦［Euphorbia taihsiensis（Chaw et Koutnik）Oudejians.］、千 根 草（Euphorbia thymifoliaL.）這幾種較為常見且常?；焐参镄螒B(tài)和藥材性狀也極為相似［16，17］，這就造成斑地錦鑒別困難，從而無法準(zhǔn)確確定其來源。本研究采用DNA 條形碼技術(shù)對廣西產(chǎn)斑地錦及混淆品進(jìn)行鑒別，有助于提高斑地錦臨床用藥的準(zhǔn)確性，同時為地錦草組植物的鑒別提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器和試劑 儀器：ES2220M 型電子天平（普利賽斯公司），Milli-Q Biocel 型純水儀（Millipore 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限 公司），Thermal Cycler-T100 型梯 度PCR 儀（BIORAD 公司），H1650-W 型高速離心機(jī)（湘儀公司），GelDoc XR+型全自動凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD公司），HWS-24 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），TGem Plus 型超微量分光光度計（天根生化科技（北京）有限公司）。試劑：2×Reaction Mix 緩沖液、D2000 DNA Marker、DNase/RNase-Free Deionized Water（TIAN GEM 公 司）；GelGreen（41003，Biotium）；1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）、6×DNA Loading Buffer（Solarbio）、氯化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）、瓊脂糖（博格林生物）、無水乙醇、異丙醇、氯仿（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、CTAB（美侖生物科技有限公司）。

1.1.2 樣品 采自廣西壯族自治區(qū)的斑地錦及其混淆品樣品共41 份，經(jīng)鑒定為大戟科大戟屬斑地錦、匍匐大戟、臺西地錦及千根草，樣品具體信息如表1所示。

表1 斑地錦及其混淆品的樣品信息

1.2 試驗方法

1.2.1 提取DNA 取100 mg 斑地錦及混淆品樣品地上部分置于研缽中加液氮迅速研磨成粉末，將其轉(zhuǎn)入已滅菌的2 mL 離心管中，加入750 μL 預(yù)熱的DNA 提取緩沖液［2% CTAB，2% β 巰基乙醇，100 nmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20 nmol/L EDTA（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，2% PVPK 40］搖勻。65 ℃水浴1 h，每隔10 min 振蕩1 次。取出后加入預(yù)冷的650 μL 氯仿-異戊醇（24∶1）振蕩搖勻，1 200 r/min，離心10 min后取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL 滅菌離心管中，加入2/3 體積預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒搖勻。于-20 ℃下沉淀1～2 h，1 200 r/min，離心5 min 后去廢液。750 μL 無水乙醇洗2 次，自然風(fēng)干。加入50～80 μL TE 緩沖液溶解DNA，-20 ℃條件下保存。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測序 PCR 反應(yīng)體系為25 μL，其 中2×Reaction Mix 12.5 μL，Golden DNA Polymerase 0.2 μL，模板DNA 2 μL，正向反向引物各1 μL，滅菌ddH2O 8.3 μL。rbcL 和psbA-trnH 引物均由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成（表2）。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，退火1 min（rbcL 退火溫度為52 ℃，psbA-trnH 為51 ℃），72 ℃延伸1 min，35 次循環(huán)，末次循環(huán)后72 ℃延伸5 min。將獲得的單一明亮條帶的PCR 產(chǎn)物送至廣州華大基因公司進(jìn)行雙向測序。

表2 rbcL 和psbA-trnH 引物

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用GenBank 數(shù)據(jù)庫Blast 檢測所測序列的準(zhǔn)確性和方向性，利用BioEdit 對序列進(jìn)行人工校正［18］，去除引物片段。此外，從GenBank 獲取了13 份斑地錦及其混淆品的rbcL 和psbA-trnH序列用于后續(xù)的分析（表3）。利用MEGA 7.0 對所有材料rbcL 和psbA-trnH 序列的變異位點進(jìn)行分析［19］，基于K2P 模型計算種內(nèi)和種間遺傳距離，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建斑地錦及混淆品的系統(tǒng)發(fā)育樹，利用bootstrap（1 000 次重復(fù)）檢驗各分支的支持率。

表3 斑地錦及其混淆品樣品GenBank 序列號

2 結(jié)果與分析

2.1 rbcL 和psbA-trnH 序列特征

由表4 可知，所有品種的rbcL 序列長度均為548 bp，其中斑地錦種內(nèi)存在3 個變異位點，斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草的種間變異位點分別為5、5、4個；除土庫曼大戟外（不含psbA-trnH序列），其他品種的psbA-trnH 序列長度均為631 bp，斑地錦種內(nèi)存在2 個變異位點，斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草種間變異位點分別為13、17、14 個。

表4 斑地錦及其混淆品樣品的rbcL 和psbA-trnH 序列分析

2.2 種內(nèi)及種間遺傳距離

通過MEGA7.0 軟件，基于K2P 模型對斑地錦樣品及其混淆品的種內(nèi)和種間遺傳距離進(jìn)行計算，結(jié)果見表5、表6?；趓bcL 序列分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，斑地錦種內(nèi)遺傳距離為0.000，明顯小于其與各個混淆品間的遺傳距離，其與臺西地錦的種間遺傳距離最大，為0.007；匍根大戟與土庫曼大戟以及與臺西地錦間的遺傳距離均為0.000。基于psbA-trnH遺傳距離分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草、地錦草、匍根大戟的種間遺傳距離分別為0.012、0.016、0.013、0.014、0.012。

表5 斑地錦與其混淆品樣品rbcL 序列的遺傳距離

表6 斑地錦與其混淆品樣品psbA-trnH 序列的遺傳距離

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以蓖麻（BM）作為外群，基于K2P 模型構(gòu)建了斑地錦和混淆品樣品的rbcL 和psbA-trnH 序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1 所示。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，斑地錦樣品及其混淆品各自形成單系且均有較高支持率，這表明rbcL 和psbA-trnH 序列均可用于斑地錦與其常見的混淆品鑒別。

圖1 斑地錦及混淆品的NJ 樹

3 小結(jié)與討論

在本研究中，基于rbcL 序列分析發(fā)現(xiàn)，匍根大戟和臺西地錦的種內(nèi)及種間遺傳距離均為0.000，該基因片段無法將兩者區(qū)分開；基于psbA-trnH 序列發(fā)現(xiàn)兩者之間遺傳距離為0.003，可進(jìn)行有效區(qū)分；在系統(tǒng)發(fā)育樹中，這2 種樣品形成一個大的分支，支持率為96%，表明兩者間親緣關(guān)系較近。rbcL、psbA-trnH 這2 個序列無法將同一品種不同來源的樣品進(jìn)行區(qū)分，但基于rbcL 序列分析發(fā)現(xiàn)，采集于柳州市的斑地錦的種內(nèi)遺傳距離為0.001，而采集于南寧市和桂林市的斑地錦種內(nèi)遺傳距離均為0.000，表明來源于柳州市的斑地錦種內(nèi)差異較大。

DNA 條形碼技術(shù)有種屬保守性，又有近緣物種的特異性［20，21］，線粒體psbA-trnH 序列是被子植物葉綠體基因組中變異位點最多的序列之一［22，23］，在藥材鑒定中有著較廣泛的應(yīng)用，具有較好的植物種間鑒別作用。rbcL 可單獨或與其他基因片段組合用于植物種群的鑒定、分類等研究［24］。高節(jié)點支持率能在物種鑒定和計量系統(tǒng)發(fā)育多樣性時提供無偏差的估計，并獲得較為可信的結(jié)果［25，26］。本研究發(fā)現(xiàn)，rbcL 與psbA-trnH 組合構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹具有高節(jié)點支持率，分支聚類結(jié)果可信，可用于斑地錦與其常見混淆品的鑒別。僅使用葉綠體基因片段或核基因片段鑒定物種，鑒別成功率往往較低，而將基因片段進(jìn)行組合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹則有利于提高物種DNA 條形碼鑒定效果［27］。