田金鳳，張喆，孫卓然，尚遠(yuǎn)宏*

1. 攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院（攀枝花 617000）；2. 呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心（呼和浩特 010070）

咖啡，茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，為常綠灌木或小喬木[1]。目前，咖啡主要以原豆經(jīng)烘焙、研磨、沖泡或煮沸的方式制成大眾休閑飲料，其產(chǎn)量和消費(fèi)量逐年增加，其中速溶咖啡是從炒磨咖啡豆中提取有效成分后經(jīng)干燥而生產(chǎn)的[2]，而烘焙咖啡是咖啡豆經(jīng)烘焙工藝后再加工處理而得到的?？Х壬a(chǎn)過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)丙烯酰胺現(xiàn)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)問題，丙烯酰胺屬于二類致癌物[3]，存在于一些不同的熱處理食品中，而咖啡飲料中的丙烯酰胺的來源主要集中在烘焙或加熱處理階段[4]。在我國(guó)目前標(biāo)準(zhǔn)中GB 5009.204—2014和GB 31604.18—2016僅是關(guān)于“食品中丙烯酰胺的測(cè)定”和“食品接觸材料及制品丙烯酰胺遷移量的測(cè)定”，尚未有明確界定專屬于咖啡中丙烯酰胺的限量標(biāo)準(zhǔn)或最大殘留限量值規(guī)定[5-6]。隨著飲食習(xí)慣的改變和西方文化的影響，咖啡在我國(guó)越來越普及，因而國(guó)家在咖啡生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制丙烯酰胺形成途徑，有必要建立咖啡中丙烯酰胺的痕量檢測(cè)方法。

咖啡中成分復(fù)雜、干擾物較多，測(cè)定過程中的難度較大，目前還沒有成熟可靠、快速準(zhǔn)確的方法[7]，而以“丙烯酰胺”“咖啡”“arcylamide”“coffee”為檢索詞，從“CNKI”和“Elsevier SDOL”數(shù)據(jù)庫(kù)檢索近10年（2011—2021年）文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)咖啡中的丙烯酰胺含量的方法和結(jié)果，具體見表1。同時(shí)近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是測(cè)定咖啡中丙烯酰胺含量方法中最為提倡和通用的檢測(cè)手段，但樣品前處理對(duì)雜質(zhì)干擾處理效果不佳或丙烯酰胺在色譜分析中分離效果和靈敏度有待進(jìn)一步提高。此次試驗(yàn)在前人研究工作的基礎(chǔ)上，適當(dāng)改進(jìn)了樣品前處理方法，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)咖啡中丙烯酰胺進(jìn)行了測(cè)定，具有此色譜分析高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，其方法的回收率和重現(xiàn)性好，可滿足咖啡中丙烯酰胺含量的評(píng)估檢測(cè)。

表1 咖啡中的丙烯酰胺的測(cè)定方法和測(cè)定結(jié)果范圍

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；FA2014B電子天平（上海越平公司）；Milli-Q IQ7000超純水器（美國(guó)Millipore公司）；1-14k離心機(jī)（Sigma公司）；VORTEX 4渦旋混合器（LMS公司）；NEVAP-45氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；MCX固相萃取柱（800 mg/6 mL）。

色譜級(jí)甲酸、乙腈，F(xiàn)isher公司；丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于98%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。樣品為市售不同廠家的咖啡商品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取0.0100 g的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用水溶解并定容至10 mL，質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，于-20 ℃避光保存。其他質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定量稀釋即得。

分別稱取0.0100 g的13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用水溶解并定容至10 mL，質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，于-20 ℃避光保存。其他濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定量稀釋即得。

1.2.2 樣品前處理

提?。悍Q取2.0 g（精確到0.01 g）咖啡樣品，置于50 mL離心管中，加入100 μL13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液（4 mg/L），靜止后加9 mL水并渦旋使試樣分散，再加入10 mL乙腈和5 mL正己烷渦旋1 min后，加入1.5 g無(wú)水醋酸鈉和6 g無(wú)水硫酸鎂搖床振搖1 h，以4 ℃，以10 000 r/min離心8 min，取乙腈層，待凈化。

凈化：取3 mL乙腈層過已活化的MCX固相萃取柱，直接收集上柱的乙腈溶液，在氮?dú)庀麓蹈?，?.3 mL水溶解殘?jiān)^0.22 μm濾膜后，即得。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱，Waters BEH-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A，0.1%（V/V）甲酸-水溶液；流動(dòng)相B，乙腈；梯度洗脫；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；洗脫程序：0～1.2 min，流動(dòng)相A為90%；1.2～3 min，A由90%降至10%；3～4.5 min，A為10%；4.5～5 min，A由10%升至90%；5～6 min，A為90%。

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正、負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；輔助氣（AUX）流速10 L/min；輔助氣溫度（TEM）300 ℃；電噴霧電壓（IS）3 500 V。丙烯酰胺藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)

1.2.4 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

配制好的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋成500 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白咖啡基質(zhì)提取液將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成5，10，25，50，100和250 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，其中含50 μg/L內(nèi)標(biāo)13C3-丙烯酰胺。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，采用外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢出限（LOD）與定量限（LOQ）[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件和儀器條件優(yōu)化

樣品提取過程中首先用正己烷將脂肪及低極性化合物除去[7]，再把無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水醋酸鈉作為除水劑，醋酸鈉則加大水中的離子強(qiáng)度，因鹽析作用將樣品中水層和有機(jī)試劑乙腈層分離，而無(wú)水硫酸鎂是由于其和水分子結(jié)合來起到除水作用[19-20]。儀器條件中，流動(dòng)相中加入少量甲酸能夠達(dá)到改善峰形、提高分離效率的作用，且可以為丙烯酰胺提供必需的質(zhì)子來源，提高其離子化效率；在ESI+模式下，優(yōu)化碰撞能量，丙烯酰胺經(jīng)過兩級(jí)碰撞掃描后，產(chǎn)生不同強(qiáng)度的離子碎片，分別以響應(yīng)值最大的荷質(zhì)比（m/z）作為各目標(biāo)化合物的定量離子，丙烯酰胺在250.0 μg/L時(shí)的MRM色譜圖見圖1。

圖1 丙烯酰胺及內(nèi)標(biāo)的定量離子色譜圖

2.2 方法的線性關(guān)系及檢出限

向空白咖啡基質(zhì)溶液中加入系列丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，以峰面積對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。由表3可知，在5.0～250.0 μg/L線性范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）＞0.999。定量限為1.0 μg/kg，檢出限為0.5 μg/kg。結(jié)果表明，方法的靈敏度能滿足檢測(cè)要求，并優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5]。

表3 丙烯酰胺的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 方法的回收率與精密度

以1，5和10 μg/kg的水平將丙烯酰胺添加到空白咖啡基質(zhì)中（空白樣品分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，各6份），測(cè)定回收率，結(jié)果見表4。丙烯酰胺在咖啡中的回收率范圍為81.2%～89.3%，SRSD為5.1%～6.3%。

表4 丙烯酰胺的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 實(shí)際樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)市售烘焙咖啡和速溶咖啡各10個(gè)樣品中的丙烯酰胺進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，烘焙咖啡中丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為71.2～103.1 μg/kg，速溶咖啡中丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為5.5～316.1 μg/kg。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)結(jié)合固相萃取技術(shù)，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了咖啡中丙烯酰胺的分析測(cè)定方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其檢測(cè)定量限（SLOQ）為1 μg/kg，小于GB 5009.204—2014標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)低限（10 μg/kg），在實(shí)際檢測(cè)中具有較強(qiáng)的可行性和實(shí)用性，可用于食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)咖啡樣品中丙烯酰胺含量的測(cè)定。